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目的:探讨淫羊藿苷（Icariin,ICA）调节脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的巨噬细胞极化的影响及其作用机制。方法:1.大鼠腹腔巨噬细胞鉴定:免疫荧光技术鉴定大鼠腹腔巨噬细胞的表面标志物CD68。2.ICA对LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞极化影响:将大鼠腹腔巨噬细胞随机分为Control组、LPS组、ICA（0.1μM、1μM、10μM）+LPS组。按分组给予ICA,2 h后加入终浓度100 ng/m L的LPS继续作用4 h。采用MTT检测ICA对大鼠腹腔巨噬细胞的细胞活力影响;光学显微镜观察ICA对大鼠腹腔巨噬细胞形态的影响;RT-PCR检测ICA对LPS诱导的M1型大鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6、Arg-1 m RNA水平;Western blot检测ICA对LPS诱导的M1型大鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6、Arg-1、i NOS、CD206的蛋白水平。3.ICA调节LPS诱导的巨噬细胞极化的作用机制（1）ICA对LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞模型TLR4/MyD88通路的影响:分组及给药方案同上,通过Western blot检测TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白量的变化。（2）ICA对LPS诱导的TLR4基因突变RAW264.7细胞模型TLR4/MyD88通路的影响:为了进一步确定ICA的作用机制,选择RAW264.7为受试细胞,以保证TLR4突变基因的稳定表达。具体方法为:（1）分子对接:采用Auto Dock Vina软件对ICA和TLR4（PDB:5IJC）进行半柔性分子对接,确定ICA与TLR4的结合位点;（2）突变点的选择:通过DUET数据库筛选最佳突变位点;（3）根据确定的最佳突变位点,构建TLR4氨基酸序列上第439位S突变为R氨基酸残基的过表达腺病毒载体（OE-S439R-TLR4）,同时构建野生型过表达腺病毒载体（OE-WT-TLR4）;（4）转染:将含有MOI=500的空载腺病毒、OE-WT-TLR4和OE-S439R-TLR4腺病毒分别对RAW264.7细胞株进行感染;（5）转染效果鉴定:转染后分组为Control组、空载病毒（Null）组、OE-WT-TLR4组、OE-S439R-TLR4组,采用荧光显微镜观察腺病毒转染RAW264.7细胞株的GFP效率（细胞荧光数/总细胞数）,Western blot检测转染标签蛋白DYKDDDDK Tag及TLR4蛋白表达;（6）突变株TLR4功能鉴定:设OEWT-TLR4组、OE-WT-TLR4+LPS组、OE-S439R-TLR4组、OE-S439R-TLR4+LPS组,Western blot检测TLR4、MyD88蛋白表达水平以判断TLR4的功能是否尚在;（7）ICA对LPS诱导的TLR4基因突变RAW264.7细胞模型TLR4/MyD88通路的影响:设OEWT-TLR4组、OE-WT-TLR4+LPS组、OE-WT-TLR4+LPS+ICA（10μM）组、OEWT-TLR4+LPS+TAK-242（TLR4抑制剂）组;OE-S439-TLR4组、OE-S439RTLR4+LPS组、OE-S439R-TLR4+LPS+ICA（10μM）组、OE-S439RTLR4+LPS+TAK-242组,通过Western blot检测TLR4、MyD88、TNF-α蛋白表达水平。结果:1.大鼠腹腔巨噬细胞鉴定:CD68呈阳性,表明所提取的细胞为巨噬细胞,且纯度达96%。2.ICA对LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞极化影响:ICA浓度在0.1-10μM范围之间,对大鼠腹腔巨噬细胞无明显毒性。经LPS诱导后大鼠腹腔巨噬细胞形态出现不规则梭形伪足,当ICA作用后形态趋于椭圆或圆形;大鼠腹腔巨噬细胞经LPS诱导4 h后,TNF-α、IL-6、i NOS蛋白表达显著上调,表明M1型巨噬细胞诱导成功。ICA作用后能显著抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6、i NOS的蛋白水平升高并上调CD206、Arg-1蛋白水平。此外,ICA能够显著抑制LPS诱导的腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6的m RNA水平增高,增加Arg-1 m RNA水平,表明ICA可以使LPS诱导的M1型巨噬细胞向M2型转化。3.ICA影响LPS诱导的巨噬细胞极化的作用机制研究（1）ICA对LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞模型TLR4/MyD88通路的影响:大鼠腹腔巨噬细胞经LPS诱导4 h后,TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平显著升高,ICA能够显著抑制LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平升高,表明ICA通过抑制TLR4/MyD88通路调控巨噬细胞的极化。（2）ICA对LPS诱导的TLR4基因突变RAW264.7细胞模型TLR4/MyD88通路的影响:根据ICA与TLR4蛋白分子对接结果,经DUET数据库分析,确定将TLR4蛋白439位的丝氨酸（S）突变为精氨酸（R）,并构建TLR4（S439R）点突变过表达腺病毒。Null、OE-WT-TLR4和OE-S439R-TLR4腺病毒在MOI=500时转染RAW264.7细胞的GFP阳性率=90%;OE-WT-TLR4、OE-S439R-TLR4组的TLR4及DYKDDDDK Tag蛋白水平显著升高,达Control组的1.5倍,表明TLR4过表达成功。LPS作用于OEWT-TLR4、OE-S439R-TLR4组4 h后TLR4、MyD88蛋白水平均显著性升高,表明突变株TLR4功能未受影响。ICA显著抑制LPS诱导的OE-WT-TLR4 RAW264.7细胞株TLR4、MyD88、TNF-α蛋白水平,但对LPS诱导OE-S439R-TLR4 RAW264.7细胞株TLR4、MyD88、TNF-α蛋白水平无显著影响,初步表明ICA与TLR4发挥药效的关键结合靶点可能为S439。结论:1.ICA能够将LPS诱导的M1型巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞。2.ICA调控LPS诱导的巨噬细胞极化作用与抑制TLR4/MyD88信号通路的激活有关,且作用的靶点可能为TLR4蛋白上的S439残基。