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微囊藻是一类常见的水华蓝藻,通常以群体形式存在,过度繁殖可形成大规模表面水华,破坏湖泊环境,并可能产生毒素,严重危害人类健康。目前,对于蓝藻水华的研究主要是借助生态学的手段来认识宏观层次的表象,而对于微观机制的研究不够深入,尤其是在分子水平上,对于水华蓝藻的适应性的认识不够。本研究正是以此为切入点,借助于分子生物学的研究技术,分析富营养化湖泊中蓝藻水华的发生和演替,试图对微囊藻的种群结构、漂浮力和越冬力进行深入的分析。
本文的主要研究内容和研究结果如下:
(1)利用gvpA-C基因间隔区(gvpAC-IGS)评估微囊藻种群动态。构建其克隆文库并计算不同类型序列的百分比,分析太湖梅梁湾微囊藻gvpAC-IGS基因型组成的多样性及其周年演替规律。通过对太湖梅梁湾两年多的跟踪检测,发现至少存在10种特征序列,且在调查期间,大部分时间都有优势序列类型1和类型6的存在。在2009年9至11月和2010年8月至10月两个时间段,序列类型1的比例都发生了明显的降低,显示微囊藻群体基因型在秋季发生显著演替。系统发生关系分析表明,相同采样时期太湖水域的微囊藻之间,要比跟其他生境的微囊藻的亲缘关系更近一些。
(2)以微囊藻伪空胞基因表达水平作为检测指标分析影响漂浮力的因素。通过Western blot检测证实在pH>8.0条件下,微囊藻FACHB930的GvpC表达水平提高,其漂浮能力也显著提高。在云南滇池检测微囊藻的GvpC水平与水体pH值在一天中的变化,其结果与此相吻合。进一步分析发现pH对GvpC的调控不是通过影响无机碳的形式发挥作用的。此外,氮源缺乏可显著减少微囊藻GvpC表达水平,但RT-PCR分析显示缺氮并不显著影响伪空胞基因丛的转录水平。
(3)越冬蓝藻活力的荧光检测法。借助荧光显微拍摄和荧光分光光度计,证实SYTO9和碘化丙锭(PI)双荧光染色法可以应用于评价蓝藻的细胞存活力。将此方法应用于野外的微囊藻,证实在整个冬季太湖梅梁湾水域的浮游微囊藻群体仍然处于存活状态。同时,Western blot检测了同时期微囊藻样品中抗寒关键蛋白Rbp1的表达变化,发现在夏季样品中Rbp1基本不表达,而在入秋温度降低之后,Rbp1表达量显著提高,一直延续至冬季之后。这一结果与双荧光染色法检测结果相吻合。
通过以上研究,本文得到的主要结论足:
(1)gvpAC-IGS适合于微囊藻种群多样性分析,太湖微囊藻在秋季发生显著的种群演替;
(2)伪空胞基因的表达水平与微囊藻漂浮力直接相关,在pH8.0-10.0的范围内pH升高可提高微囊藻伪空胞蛋白水平和漂浮力,pH的作用与无机碳形式无关;
(3)SYTO9和PI双荧光染色法适合于越冬微囊藻存活力的检测。