玉米纹枯病是由立枯丝核菌Rhizoctonia solani K(u|¨)hn引起的真菌性病害,已成为制约我国西南玉米主产区产量的主要病害之一,研究纹枯病的抗病机制,是培育广谱、高效、稳定、持久抗病性品种的基础。microRNA(简称miRNA)是真核生物体内的一类负调控因子,在植物生长发育调节和病害防御中担任重要角色。本研究以纹枯病抗感自交系为材料,通过人工接种,从不同组织分离与克隆纹枯病病菌侵染条件下表达的miRNA,通过相关生物信息学软件预测miRNA的靶基因并进行功能分析,结合miRNA在抗、感病材料之间的表达差异,初步探讨分离的miRNAs在抗玉米纹枯病途径中的机制与角色,为通过生物技术方法培育与改良纹枯病抗性品种奠定基础。主要研究结果如下:1.在R15(抗)和掖478(感)叶片组织构建的小分子RNA文库中共筛得79条大小在17-27 nt的小RNA,主要富集在20-24 nt范围内,去除tRNA、rRNA以及降解序列之后,通过mfold分析序列在基因组上是否形成符合miRNA前体的二级结构,结果得到长度范围在18-23 nt的11条符合标准的序列。其中miR-6与zea-miR168a的前体序列相同,是同一前体产生的miRNA和miRNA*。2.这11条序列中有一条是已发现的玉米miRNA zea-miR168a,余下的10条序列有4条5’端第一个核苷酸为“U”,这些特点和其它已鉴定的植物miRNA一致。进一步对它们进行物种间保守性分析发现,其中有6条序列在水稻、小麦和拟南芥中存在不同程度的保守性,总体趋势表现为在水稻和拟南芥中的保守性高于小麦。3.通过miRU植物miRNA靶基因预测软件和CSRDB、NCBI数据库以及pfam氨基酸功能域分析软件,预测10条新发现的候选miRNA可能作用于20条靶序列,靶基因功能分类发现:这些靶基因涉及抗病防御相关途径(20%)、初级次级代谢(20%)、信号传导(30%)、转录调控(15%)和蛋白质修饰加工(15%)等。4.通过加尾-引物延伸RT-PCR法,对以上发现的11条候选miRNA在抗病材料R15和感病材料掖478中的表达进行了检测,结果发现其中9条miRNA在抗感病材料中均有表达,证明这9条miRNA分子在病菌胁迫下的玉米组织中真实存在,其中有8条miRNA序列是新发现的,归属8个新的miRNA家族。5.采用实时荧光定量PCR法对这9条miRNA在抗感病材料接菌处理和不接菌对照下不同组织的相对定量表达进行了分析,结果表明,病菌胁迫下zea-miR168a、miR-2、miR-6在抗感材料中的表达特征趋于一致,均表现为在抗病材料中高丰度表达:miR-4、miR-7、miR-9的表达特征也趋于一致,均表现为接菌后在抗病材料叶鞘上调表达,而感病材料叶鞘和叶片中下调表达。除miR-4和miR-5外,其余miRNA在抗病材料R15叶鞘处理中的相对表达量均高于感病材料掖478。miR-3可能是一种仅在病菌侵染部位高丰度表达的小RNA;miR-5在抗感材料的处理和对照中表达差异不显著。6.综合miRNA预测靶基因的相关功能分析与抗感材料的表达特征分析,本研究获得的玉米miRNA调控抗病可能的机理总结如下:第一,在病菌胁迫下,玉米叶鞘部位对病菌的侵染表现的更为敏感,与叶片处理相比,叶鞘处理部位相关的miRNA应激表达更为迅速;在病菌直接作用部位,R15(抗)与掖478(感)材料相比,miRNA应激表达更迅速,强度更高。第二,表达特征分析表明,zea-miR168a、miR-2、miR-6和miR-4、miR-7、miR-9可能分别属于两类小RNA。病菌胁迫均能诱导这两类miRNA的表达量发生变化,暗示两类miRNA与植物的抗病免疫调控相关。第三,miRNA调控可能是引起玉米对外来病菌侵染做出防御反应的原因:miRNA在抗病材料中的高丰度表达,通过在病菌侵染过程中调控抗病途径中的关键酶和转录因子,提高病菌侵染处的防御机制以抵御病菌的入侵或防止病菌的扩大化侵染。第四,在外来生物胁迫下,miRNA的特异表达可能是玉米抵抗病菌胁迫的结果:受到外来病菌胁迫影响,参与miRNA剪切过程的相关关键蛋白以及调控miRNA基因表达的转录因子等的表达量发生了变化,从而促进或抑制了细胞内miRNA的表达,进而这些miRNA所调控的基因的表达也发生了变化,最终表现为植物对外来病菌的抗感病性。本研究获得9个可能与纹枯病抗性相关新的miRNA,初步分析这些miRNAs在抗玉米纹枯病途径中的机制与角色,为通过人工miRNA等生物技术策略培育与改良玉米纹枯病抗性品种奠定了前期基础。