转基因植物研究及其产业化的飞速发展对其检测方法提出了更高的要求。目前常用的检测方法主要分为三类：生物测定(实验室及田间检测)、DNA水平检测(PCR、Southern blotting等)和蛋白质水平检测(ELISA、Western blotting)。但这些常规方法耗时、耗力，工作量大，不适于转基因植物的快速检测。因此，建立转基因植物快速、方便、有效的检测方法十分必要。 本研究运用胶体金标记免疫检测技术，初步建立了抗虫基因CryIA(e)、SCH(Signal-CryllBal-HDEL)、CpTI和标记基因Hpt等四种转基因植物胶体金标记快速检测试剂盒。主要工作结果如下： 1、将重组质粒pGEX-4T-3-Hpt在E．coli中高效表达，利用亲和层析的方法对表达的GST-HPT融合蛋白进行纯化，并进一步获得HPT蛋白。以纯化的HPT蛋白免疫新西兰大白兔，得到相应的多克隆抗体，经间接ELISA法检测，抗体能与HPT蛋白特异性结合，其相关系数达到极显著水平，满足转基因植物的ELISA和金标试剂盒的检测要求。 2、应用饱和硫酸铵法纯化待标记的四种抗体，CryIA(e)抗体浓度为8643.42μg／ml，SCH抗体浓度为9575.82μg／ml，CpTI抗体浓度为9485.01μg／ml，HPT抗体浓度为9732.16μg／ml。采用间接法测纯化后抗体的效价，CryIA(e)抗体效价＞1：10，000，SCH抗体效价＞1：8000，CpTI抗体效价＞1：7，000，HPT抗体效价＞1：16，000。 3、采用柠檬酸三钠还原法制得直径约15nm的胶体金。经电镜拍摄显示该胶体金颗粒大小均匀一致，基本相同，无椭圆形及多角形的金颗粒存在，且呈清亮透明的酒红色，放置半年后仍十分稳定，未见沉淀及变色现象。经检测得每毫升胶体金中标记抗体的稳定量分别如下：CryIA(e)抗体为60μg，SCH抗体为48μg，CpTI抗体为66μg，Hpt福建农林人学硕卜学位论文:四种转摧因植物胶体金标记快速检测试剂盒的研制打L体为60件g。研制出转快速检测试纸盒。份yIA介夕、SCll、印Tl 111 Ilnt基因植物胶体金标一记试剂盒的检测结果确定时间为:强阳性样品在5分钊，内即可在检测线看到红色胶体金聚集体，弱阳性样品则需半小时左右方可确定。检测结果以测试条硝酸纤维素膜上出现两条红色条带(检测线和质控线)为阳性，出现一条红色条带(质控线)为阴性，若没有红色条带出现，则试剂盒失效。 5、以ELISA检测结果为标准，将试剂盒检测结果与ELISA结果进行对照，得出金标试剂盒检测价丁IA(e)的灵敏度为96.0%，特异性为100%，符合率为96.1%;检测SCH的灵敏度为90.1%，特异性为91%，符合率为90%:检测即7’I的灵敏度为92.4%，特异性为97%，符合率为94%;HPt标记的转基因植物的检测工作目前还在进行中。经HPt纯蛋白检测其特异性良好。 6、研制的金标试剂盒的热稳定性实验表明，试剂盒于低温密封干燥处贮存可保质半年。 我们研制的转基因植物胶体金标一记快速检测系统与常规的检测方法相比，具有单份操作、简单、快速、无污染等优点。国内目前还未见文献报道运用胶体金标记技术检测转基因植物。关于转基因植物胶体金标一记快速检测系统的相关专利己在申请中。