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研究背景:膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是以膝关节疼痛和功能障碍为主要临床表现的常见退行性骨关节病,针刀治疗KOA有较好的疗效,本课题组前期以韧带生物力学和软骨力学信号的传导为切入点,对针刀治疗KOA的短期作用机制有了初步探讨,但仍缺乏长期疗效观察及作用机制的研究内容,本研究依托国家自然科学基金"针刀干预对膝骨关节炎韧带力学改变及软骨细胞力学信号转导的影响"的部分内容,在前期工作基础上,继续探讨针刀治疗KOA的"调筋治骨法"的长期效应机制。研究目的:本研究拟以改良后左后肢伸直位固定法的KOA兔模型为研究对象,从中医经筋学说出发,结合针刀医学对KOA发病机制的动态力平衡失调的认识,运用X-ray、光镜、扫描电镜、Real-time PCR、Western Blot等技术,观察软骨形态学、韧带基质胶原相关因子及软骨细胞凋亡因子基因和蛋白的表达,验证针刀通过调控韧带基质,减缓韧带刚性,增强弹性,减轻韧带对关节软骨不良应力刺激,阻抑软骨细胞的凋亡和退变的假说,揭示针刀通过矫正"伤筋"而"正骨"的科学性,为临床治疗KOA远期疗效的机制研究提供一定的实验依据。研究方法:选用6月龄雄性健康新西兰家兔,随机分为4组,分别为正常组、模型组、针刀组和电针组,以改良后左后肢伸直位固定制动法制备KOA兔模型,后两组以造模后1周开始干预治疗,针刀组以膝关节内、外侧副韧带及髌韧带为松解对象,以纵疏横剥法进行针刀松解,每周1次,共治疗3周;电针组取阴陵泉、阳陵泉、内膝眼、外膝眼,电针频率2/100 Hz,强度3mA,每次电针20 min,每周治疗3次,共3周。于造模后及取材前对各组兔的行为学进行评价、取材前对各组兔影像学进行检测;取材后,以光镜和扫描电镜观察各组兔软骨的病理学表现;以Real-time PCR法和Western blot法检测韧带转化生长因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)及软骨细胞凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3基因和蛋白表达水平,最后对上述指标进行比较分析。研究结果:1行为学观察示:造模后,模型组、针刀组、电针组行为学评分较正常组均明显升高(P<0.01),治疗结束3周后,针刀组、电针组评分较模型组降低(P<0.01),且针刀组积分改善程度明显(P<0.01)。说明治疗结束3周后,针刀干预对KOA兔关节疼痛、活动度、肿胀和步态等行为学指标亦有改善。2影像学观察示:正常组兔X线膝关节面光滑,软骨下骨密度均匀,关节间隙正常;模型组兔可见明显关节间隙变窄,有明显关节边缘骨赘形成,关节面粗糙,软骨下骨可有高密度影。X线评分示干预治疗后有不同程度改善:针刀组、电针组与模型组比有极显著性差异(P<0.01),针刀组与电针组相比无明显差异(P>0.05)。3软骨光镜观察示:正常组软骨表面光滑,结构清晰完整;模型组软骨表面时有剥脱缺损,细胞排列紊乱,潮线模糊或见双重潮线;针刀组软骨表层较光滑,结构基本正常,细胞排列较整齐;电针组软骨表层可见局部缺损,细胞排列轻度紊乱,或有血管翳生成。干预治疗后,针刀组及电针组表现介于正常组与模型组之间,Mankin评分示针刀组、电针组评分与模型组相比均有极显著差异(P<0.01),针刀组与电针组无明显差异(P>0.05)。4软骨扫描电镜观察示:针刀组及电针组对KOA兔膝关节软骨均有不同程度的改善,从软骨表面完整性及表面的无定性物质分布,裂隙的大小及胶原纤维的表现来看,针刀组KOA软骨的扫描电镜的观察结果更优于电针组。5软骨Real-time PCR法和Western blot法检测结果示:造模后,Bcl-2 mRNA表达量、Bcl-2/BaxmRNA比值较正常组明显降低(P<0.01),Bax、Caspase-3mRNA表达量明显升高(P<0.01);Bcl-2蛋白表达量、Bcl-2/Bax蛋白比值及Bax的蛋白表达水平与正常组相比无统计学意义(P>0.05),Caspase-3蛋白表达水平较正常组明显升高(P<0.01)。治疗结束3周后,针刀组、电针组Bcl-2 mRNA、BcⅠ-2/Bax mRNA比值表达量较模型组均显著升高(P<0.01),Bax、Caspase-3 mRNA表达量较模型组均显著降低(P<0.01);针刀组、电针组Bcl-2蛋白表达量、Bcl-2/Bax蛋白比值较模型组均有上升趋势,但与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05),两组Caspase-3蛋白表达水平较模型组显著降低(P<0.01),且针刀组与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)。上述结果提示,造模后引起了软骨细胞凋亡过程的发生,针刀干预3周后仍能上调Bcl-2、Bcl-2/Bax基因和蛋白表达比值,下调Caspase-3基因和蛋白表达水平,对阻抑KOA软骨细胞凋亡进程有更好的调控作用。6 韧带 Real-time PCR 法和 Western blot 法检测结果示:造模后,TGF-β 1、Col-Ⅰ mRNA及蛋白表达水平较正常组均明显上升(P<0.01),治疗结束3周后,针刀组及电针组TGF-β1、Col-ⅠmRNA表达水平均低于模型组(P<0.01,P<0.05),TGF-β1、Col-Ⅰ蛋白表达水平较模型组亦有下降趋势,其中针刀组TGF-β 1蛋白表达水平与模型组相比有极显著性差异(P<0.01);针刀组TGF-β 1、Col-Ⅰ基因及蛋白表达水平均低于电针组,TGF-β 1、Col-Ⅰ基因表达量与电针组相比差异明显(P<0.05)。结论:1针刀干预通过抑制韧带TGF-β1和COL-Ⅰ的基因及蛋白水平的过度表达,调节韧带基质,恢复韧带的结构和功能,改善KOA力学平衡。2针刀干预可以减缓KOA关节软骨细胞凋亡进程,阻抑KOA病理进程。3针刀干预通过恢复膝周韧带的结构和功能,有利于关节的稳定性,从而减少软骨的不良刺激,阻抑其凋亡过程及进一步损伤可能是其治疗KOA的长期效应机制之一。