目的：　　骨髓间充质干细胞(MSC)是一种成体多能干细胞，具有自我复制和未分化的特点，在体外具有多向分化潜能，体内能够向损伤部位迁移并且分化成多种功能的细胞和组织器官，修复受损的心、脑、肺、肾等组织。MSC的归巢是其发挥修复作用的关键的第一步，有研究发现在急性肾衰竭中，透明质酸可以通过与其在MSC表面的受体CD44之间的结合促进外源性MSC归巢于受损肾脏。基于此研究，我们推测在慢性肾衰竭过程中，也存在透明质酸的表达异常，并且能够诱导MSC的归巢，即通过透明质酸和MSC表面受体CD44的相互作用来使趋化MSC归巢于受损的肾脏组织，进一步发挥肾脏保护作用，本文拟从以下三个方面进行研究:1、建立5/6肾切除大鼠肾小球硬化模型;观察模型建立过程中各时间点透明质酸的表达变化。2、5/6肾切除模型中MSC的归巢与透明质酸的关系。3、MSC延缓5/6肾切除残肾纤维化的研究。　　材料和方法：　　第一部分:62只大鼠随机分成两组:假手术组17只（只进行麻醉，手术分离脂肪囊和肾被膜，不进行肾脏切除），5/6肾切除组45只（二步法进行5/6肾切除），继续正常饮食，手术后2周，选取各组存活的大鼠（假手术组16只，5/6肾切除组35只）进一步随机等分为4wK组、8wK组、12wK组、16wK组、20wK组（即分别于术后第4、8、12、16、20周处死大鼠，其中模型组各组6-7只，假手术组各组3-4只）。处死大鼠后收集血标本行血肌酐和尿素测定，留取残肾组织，应用HE、Masson染色观察肾小球硬化指数和肾间质损伤指数的变化，应用免疫组化、免疫印记来观察不同第4、8、12、16、20周透明质酸和TGF-β1的表达变化。　　第二部分:培养购买的稳定转染绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞株(MSC/GFP)，37℃和5％ CO2的恒温箱中进行细胞培养，细胞传代2-3次，待细胞生长良好，在细胞融合达到70-80％时开始实验。　　将生长良好的MSC消化后调整浓度为104/ml，进行体外迁移实验研究，即分别在Transwell的上室加入MSC和BU75孵育后的MSC（BU75为CD44抗体，能够阻断CD44与透明质酸的结合），分别在Transwell的下室加入含有0、100、200、300μg/ml透明质酸的培养液，18小时后应用共聚焦显微镜观察滤膜背面的MSC的数量。　　60只大鼠在经过适应性饲养1周后随机分成两组:假手术组14只（只进行麻醉，手术分离脂肪囊和肾被膜，不进行肾脏切除），5/6肾切除组46只（二步法进行5/6肾切除），继续正常饮食，手术后2周，选取各组存活的大鼠(5/6肾切除组35只、假手术组12只)进一步随机分为MSC组23只（4wI组、8wI组、12wI组、16wI组各5-6只:即分别于术后第4、8、12、16周尾静脉注1毫升107个绿色荧光蛋白标记的MSC）和BU75组12只（8wI组、12wI组各6只:即分别于术后第8、12周尾静脉注1毫升107个BU75孵育后的绿色荧光蛋白标记的MSC），以及假手术组12只（4wI组、8wI组、12wI组、16wI组各3只:即假手术后第第4、8、12、16周尾静脉注1毫升107个绿色荧光蛋白标记的MSC）。　　注射MSC后4周处死大鼠，留取残肾组织，应用免疫荧光观察MSC归巢的数量和部位;应用双免疫荧光检测归巢后的MSC与透明质酸的相关性。　　第三部分:培养稳定转染绿色荧光蛋白的大鼠MSC，37℃和5％ CO2的恒温箱中进行细胞培养，细胞传代2-3次，待细胞生长良好，在细胞融合达到70-80％时开始实验。　　82只大鼠在经过适应性饲养一周后二步法进行5/6肾切除（同论文一）:手术后2周，选取存活的大鼠随机分成三组:模型组(n=26)、MSC治疗组(n=23)和BU75组（n=12只），模型组和MSC治疗组均进一步等分为4wI组、8wI组、12wI组、16wI组（即分别于术后第4、8、12、16周尾静脉注射1毫升生理盐水或1毫升107MSC，其中各组均为5-6只）;BU75组进一步等分为8wI组、12wI组（即分别于术后第8和12周尾静脉注射1毫升BU75孵育30分钟的MSC，各组均为6只）。　　尾静脉注射后4周处死大鼠，留取血标本和肾组织，观察肾功能、肾小球硬化指数和肾小管间质损伤指数;应用免疫组化、免疫印迹和Real-timePCR检测残肾组织中TGF-β和α-SMA蛋白表达和mRNA表达的变化。　　结果：　　第一部分:　　与假手术组相比，5/6肾切除术后第4周即开始出现肾功能异常(血肌酐70.43±3.83 vs49.33±2.03 umol/L)，肾功能进行性恶化，血肌酐第8周达到高峰（血肌酐103.33±7.35 vs45.33±7.06 umol/L），(P＜0.05)，第12周有所下降，第16周再次升高（血肌酐99.33±4.77 umol/L vs43.33±3.76），(P＜0.05)，并稳定进入慢性肾衰竭期。　　残肾组织从术后第4周开始即出现肾小球肥大、肾小管上皮细胞浊肿变性，第12周肾小球1/2面积出现局灶硬化，毛细血管袢玻璃样变，间质大部分肾小管萎缩，大量炎细胞浸润;第20周除上述改变外，间质纤维化明显加重。第4-20周肾小球硬化指数进行性增高(假手术组:0.00±0.00-1.10±0.06;模型组:0.61±0.03-3.25±0.12，P＜0.05)和肾小管间质间质损伤指数同样进行性升高（假手术组:0.07±0.03-0.07±0.03;模型组:1.23±0.10-4.27±0.09），(P＜0.05)。　　免疫组化结果:假手术组肾脏皮质几乎不表达透明质酸，髓质有部分表达，5/6肾切除术后第4周即开始有透明质酸的表达，主要表达于肾小管上皮细胞胞浆，肾小球系膜细胞胞浆、系膜区和肾间质也有少量表达;第4-20周表达逐渐增强（IOD值为7.06±0.29-30.33±0.98）;TGF-β1在假手术组无表达，5/6肾切除术后第4-20周表达逐渐增加，主要表达于肾小球系膜区、系膜细胞胞浆和肾间质，后期明显受损的肾小管上皮细胞胞浆也有较多的表达（IOD值为3.51±0.40-30.68±2.15）。免疫印记结果:透明质酸和TGF-β1在假手术组均无蛋白表达，5/6肾切除术后第4-20周透明质酸和TGF-β1的蛋白表达逐渐增强，与免疫组化结果一致(P＜0.05)。　　5/6肾切除大鼠肾脏透明质酸与血肌酐、TGF-β1、肾小球硬化指数及肾小管间质损伤指数均具有正相关性，相关系数分别为r1=0.556，r2=0.927，r3=0.934，r4=0.952(P＜0.01)。　　第二部分:　　与对照组相比，0-300μ g/ml的透明质酸对MSC的体外迁移能力有不同的影响，随着透明质酸浓度的增加，促进MSC迁移的能力也增强，存在浓度依赖性，透明质酸浓度超过200μg/ml以上不再存在浓度依赖性;应用BU75阻断透明质酸和CD44的结合能力后，试验组的MSC的迁移能力明显减弱。　　5/6肾切除术后第4-16周尾静脉注射MSC后均能够归巢于残肾组织，主要定位于受损的肾小球、扩张的肾小管和炎症细胞浸润的肾间质;第4-8周MSC注射组归巢的MSC数量逐渐增加，5/6肾切除术后第12-16周MSC注射组归巢的MSC数量逐渐减少，荧光辉度值分析分别为4wI组(6.5±1.2)×103、8wI组(9.2±2.4)×103、12wI组(8.1±1.9)×103、16wI组(4.7±0.5)×103，组间相比均具有统计学差异(P＜0.05);5/6肾切除术后第8、12周尾静脉注射应用CD44抗体中和后的MSC，结果发现分别与第8、12周MSC注射组相比，归巢的MSC数量减少，荧光辉度值分析分别为(7.3±1.5)×103和(6.6±1.1)×103，组间相比均具有统计学差异(P＜0.05);透明质酸和绿色荧光蛋白的双荧光结果显示归巢的MSC主要定位于透明质酸表达较多的区域:扩张的肾小管上皮细胞、肾小管周围和肾间质。　　第三部分:　　5/6Nx术后第4、8周应用MSC治疗的大鼠肾功能较模型组改善（4wI组血肌酐85.67±3.81vs103.33±7.35 umol/L，P＜0.05;8wI组血肌酐80.00±4.44vs95.00±4.68umol/L，P＜0.05)，但第12周、第16周应用MSC后与模型组相比，肾功能无明显改善(P＞0.05);于5/6Nx术后第8周和第12周尾静脉注射应用BU75孵育后的MSC，结果发现与MSC组相比，对残肾功能的影响无明显差别(P＞0.05)。HE和Masson染色结果发现，肾切除术后第4、8周应用MSC治疗的大鼠肾小球硬化指数和肾小管间质损伤指数较模型组改善(P＜0.05);第12、16周应用MSC后对肾小球硬化指数和肾小管间质损伤指数无明显改善(P＞0.05)，于5/6Nx术后第8周和第12周尾静脉注射应用BU75孵育后的MSC，结果发现与MSC组相比，对残肾病理改变的影响无明显差别(P＞0.05)。　　与模型组相比，第4、8、12、16周尾静脉注射MSC4周后均能减少TGF-β1和α-SMA在肾小球系膜细胞胞浆、系膜区、肾小管上皮细胞胞浆以及肾间质的阳性表达，治疗后TGF-β1的IOD值分别为4.77±0.60、9.43±0.55、16.48±0.93、20.92±1.33，各组与对应模型组相比，TGF-β1表达均减少(P＜0.05);治疗后α-SMA的IOD值分别为4.40±0.27、1143±0.36、13.08±0.56、20.08±1.48，分别与相对应模型组α-SMA的IOD值相比(分别为6.23±0.26、15.87±0.49、19.93±1.11、27.22±1.38)均明显减少，P＜0.05。免疫印记结果显示，与模型组相比，第4、8、12、16周尾静脉注射MSC4周后均能减少TGF-β1和α-SMA的蛋白表达水平(P＜0.05); RT-PCR结果显示，与模型组相比，第4、8、12、16周尾静脉注射MSC4周后均能减少TGF-β1和α-SMA的mRNA表达水平(P＜0.05)。　　结论：　　(1)在5/6肾切除模型中透明质酸表达逐渐增加，与肾小球硬化指数及肾间质损伤指数及TGF-β1表达的存在正相关。　　(2)外源性MSC能够归巢于受损的肾脏组织，主要定位于受损的肾小球和肾小管，以及炎症细胞浸润的肾间质;5/6肾切除术后第4-8周MSC归巢的数量与透明质酸量呈正相关，大部分MSC的归巢的部位与透明质酸的表达位点相同;5/6肾切除术后第12-16周MSC归巢的数量逐渐减少考虑与肾纤维化明显导致MSC前进受阻有关。　　(3)5/6肾切除术后第4、8周应用MSC治疗后能够改善受损的肾脏组织，表现为肾功能改善，肾小球硬化和肾间质纤维化程度减轻，但第12、16周MSC后不能有效改善肾功能和阻止肾纤维化的发展，与肾脏明显纤维化导致MSC归巢减少或局部微环境不利于MSC生存有关;　　(4)第4、8、12、16周应用MSC后均能有效减少TGF-β1和α-SMA的表达，MSC延缓肾纤维化的机制可能是通过旁分泌机制抑制TGF-β1的生成，抑制肾脏固有细胞转分化，从而减少细胞外基质的聚集，最终达到延缓肾纤维化的发生;　　(5)第12、16周应用MSC后虽然没有改善肾脏功能和肾脏病理改变，仍能有效减少TGF-β和α-SMA的表达，所以提示MSC在已出现明显肾纤维化时期仍然具有潜在抗纤维化的能力，未能观察到肾功能的改善和肾纤维化的减轻可能与观察时间较短有关。