低分子量透明质酸在早期肝脏缺血/再灌注损伤中的作用及机制

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目的:探讨肝脏缺血缺氧的代谢改变在恢复灌注时发展成为再灌注损伤时低分子量透明质酸的作用及机制,探讨肝脏缺血再灌注(HepaticIschemic/Reperfusioninjury,HIRI)损伤过程中由缺血造成的代谢性改变发展成再灌注损伤这种肝脏炎症反应的机制,分析低分子量透明质酸(LowMolecularWeight-HyaluronicAcid,LMW-HA)在这个过程中扮演的角色,探索肝窦内皮细胞(Liversinusoidalendothelialcells,LSEC)、肝脏枯否细胞(Kupffercell,KC)的作用。  方法:1.运用酶解法制备LMW-HA,分离小鼠肝脏LSEC和KC细胞,离体培养;2.在离体LSEC和KC常规共培养(37℃,5%CO2)的条件下,给予LMW-HA刺激,并设置相关对照组,检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase,p38MAPK)、核因子-kappaB(Nuclearfactor-κ-genebinding,NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)水平;3.在缺氧培养的条件下检测缺氧环境导致LSEC对高分子量透明质酸(HighMolecularWeight-HyaluronicAcid,HMW-HA)摄取代谢能力的变化4.在离体LSEC和KC缺氧(37℃,5%CO2,95N2)再氧化(37℃,5%CO2)共培养的条件下,给予HMW-HA刺激,设置给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC,NL)或者LMW-HA抑制物PEP-1组,检测活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS)、TNF-α水平。  结果:1.运用荧光辅助碳水化合物电泳(Fluorophore-assistedcarbohydrateelectrophoresis,FACE)方法检测证明收获分子量为小于20个双糖的的LMW-HA,运用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)及扫描电镜(Scanningelectronmicroscopy,SEM)的方法分别证明收获LSEC及KC细胞;2.通过离体LSEC和KC常规共培养体系,我们观察到LMW-HA本身无法被LSEC摄取代谢,只能作为内源性配体激活KC诱发炎症系统激活,表现为促进p38MAPK磷酸化及NF-κB活化及TNF-α的释放,而HMW-HA本身在常规共培养体系中缺乏信号分子作用。3.缺氧可以抑制LSEC摄取代谢HMW-HA的能力,且随着时间延长这种抑制作用更为明显。4.在离体LSEC和KC缺氧再氧化的共培养体系中,缺氧再氧化过程可诱生ROS增加,抗氧化剂NAC可以阻断ROS的产生;这些释放的ROS将裂解HMW-HA形成LMW-HA,并诱导KC细胞活化,释放TNF-α。  结论:在机体缺血性损伤阶段,由于LSEC的损伤,造成HWM-HA在缺氧脏器内蓄积,而在再灌注早期将产生的大量ROS,这些ROS可以降解HMW-HA为LMW-HA,成为早期激活KC的内源性配体,在缺血再灌注损伤的早期起到重要的启动作用。
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