研究目的:自上世纪50年代以来,深低温停循环（Deep hypothermic circulatory arrest,DHCA）已经成为心脑血管疾病治疗的重要辅助手段,但DHCA长时间应用会对神经功能造成缺损,成为术后病残及死亡的主要原因。因此,在有效预防DHCA并发症之前需要了解其病理分子机制。近来研究认为缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）是DHCA并发症的一个重要因素。目前的数据表明缺血/再灌注引起的损害与再灌注后的活性氧（氧自由基）产生增加密切相关。因此,在理论上可以通过对抗氧自由基减轻DHCA介导的脑神经损伤。氢气是一种新型的抗氧化剂,其具有某些独特的性能包括能直接渗透细胞膜和细胞器和能够特异性地淬灭·OH和ONOO·。有大量的证据表明氢气可以在不同的疾病或模型中抑制氧化应激引起的损伤,如肠I/R模型,心肌缺血模型,肾缺血/再灌注损伤和急性肝损伤等疾病模型。microRNA（miRNA）是约21~23个核苷酸长度的非编码小RNA,可以通过降解靶mRNA抑制蛋白翻译起到转录后水平调控基因表达。最近有研究表明氧化应激可改变细胞内miRNA表达水平。例如,氧化应激反应显著性地诱导miR-200家族（miR-200a/b/c/141/429）在卵巢癌细胞和内皮细胞中的表达。另外我们前期研究发现在大鼠DHCA模型中miR-29家族表达发生改变。在本研究中,我们将建立缺氧/复氧（H/R）及缺糖缺氧（oxygen-glucose deprivation,OGD）体外实验模型,研究氢气对H/R引起的HT-22海马神经细胞损伤的影响。此外,我们将进一步研究氢气是否通过改变对H/R相关细胞死亡起作用。研究方法:利用厌氧气包以及密闭容器建立体外H/R细胞模型。分别通过H2DCFDA和JC-1探针分析细胞氧自由基（reactive oxygen species,ROS）水平和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的改变。Western blot实验用于检测Akt,p-Akt、Bcl-2 Bax和caspase-3蛋白表达水平。利用深度测序技术检测DHCA模型大鼠海马神经元中microRNA（miRNA）的表达谱。利用定量PCR实验检测miR-200家族在HT-22细胞中的表达情况。研究结果:我们首先利用对HT-22海马神经元细胞进行缺氧18小时及复氧6小时（H18/R6）体外建立HT-22细胞缺氧/复氧模型（H/R）。在HT-22细胞H18/R6模型中,我们发现HT-22大量细胞死亡,于此同时,细胞氧自由基显著增加而线粒体膜电位明显降低。实验结果进一步显示氢生理盐水能够显著降低H18/R6造成细胞死亡,抑制ROS增加和线粒体膜电位降低。Western-blot实验显示在H18/R6细胞模型中,氢生理盐水促进了p-Akt水平（丝氨酸473）和Bcl-2蛋白的表达,而抑制了Bax和caspase-3蛋白水平。深度测序及定量PCR实验结果显示DHCA和H/R均可诱导miR-200家族（miR-200a/b/429）的表达。氢气生理盐水处理显著地抑制H/R引起的miR-200家族在HT-22细胞中的升高。此外,通过抑制miR-200家族（miR-200a/b/429）能够显著地降低H18/R6导致的细胞死亡、活性氧自由基的产生以及线粒体膜电位下降。抑制miR-200家族（miR-200a/b/429）能够在HT-22细胞H18/R6模型中促进p-Akt水平（丝氨酸473）和Bcl-2蛋白的表达,减少Bax和caspase-3蛋白表达。此次研究,我们同样发现在DHCA大鼠模型和I/R细胞模型中,miR-29a/b/c表达量显著减少。过表达miR-29a/b/c能够有效地抑制I/R导致的ROS增多及MMP下降。另外,在HT-22细胞中过表达miR-29a/b/c能够抑制Keap1、Bax和PUMA蛋白表达,而促进了Nrf2蛋白表达。进一步通过双荧光素酶报告系统及Western blot实验发现miR-29a/b/c可以靶向调控PUMA基因表达。实验结论:研究结果表明氢气生理盐水抑制H/R引起的氧化应激,进一步减少细胞凋亡和死亡。在此过程中,氢气生理盐水对HT-22细胞保护作用全部或部分依赖于其对miR-200家族的抑制。我们研究结果进一步显示miR-29家族可以靶向调控Bcl-2家族促凋亡成员PUMA,提示miR-29家族对DHCA导致的神经组织损伤有潜在的保护作用。研究结果为进一步减少DHCA相关神经组织损伤提供了新的理论基础。