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心血管疾病已经成为导致人类死亡的首要原因,而动脉粥样硬化是多种致死性心血管疾病的重要病理基础,但是在临床上普遍使用降血脂类药物的前提下,心血管疾病的死亡率仍居高不下[1].本实验室既往研究发现血管炎症也是动脉粥样硬化早期发生的重要机制,而现有的抗炎药物尚不能满足有效抑制血管局部炎症反应的效果,所以需要探索全新的抗炎靶点和手段.研究证实血管炎症反应需要募集大量的嗜中性粒细胞、单核-巨噬细胞、T细胞等免疫细胞,并参与疾病的发生、发展及转归过程[2,3],而唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族Siglec(Sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins)某些成员,如CD33rSiglecs与其特定的配体结合后,可以发挥特异性的抑制嗜中性粒细胞等炎症细胞活性的作用,提示Siglecs有可能通过调节相应炎症细胞的活性而成为调控血管炎症反应的潜在全新靶点. 随着人们对糖生物学相关的免疫研究的深入以及Siglec家族的进一步研究,发现Siglec-9/E是特异性表达于中性粒细胞、单核-巨噬细胞和 NK细胞表面的膜蛋白,与其配体结合后诱导中性粒细胞的凋亡[4]、抑制单核-巨噬细胞的浸润[5,6]、降低T细胞受体激活导致的炎症反应[7,8],参与细胞间相互作用、调节细胞活性及细胞因子的分泌等,在肿瘤以及免疫相关性疾病中扮演着重要角色[9,10].尽管现有研究对Siglec-9/E本身及其信号通路有了较深的研究,但是由于聚糖结构的复杂性与生理作用的多样性,目前对 Siglec-9/E配体的特征及其在疾病发生发展过程中的作用研究尚不够充分.本实验室于2015年在国际上率先报道了呼吸道中存在 Siglec-9/E的聚糖配体并明确MUC5B为其蛋白载体[11],随后其他课题组在Blood和JBC上报道了对红细胞和尿道表面上Siglec-9/E配体的研究[12,13],但针对血管中Siglec-9/E及其配体的研究文献尚未见报道.为此本课题拟对小鼠主动脉中Siglec-E配体的表达及变化机制进行初步探索,探讨Siglec-E在血管炎症中的调节作用,为寻找心血管疾病治疗新靶点提供实验依据,在此基础上,初步探索了我课题组既往研究的新型抗动脉粥样硬化药Compound K(20-O-b-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，CK)对该配体表达变化的作用. 方法: 1.小鼠主动脉Siglec-E配体的鉴定: 1.1.取Balbc小鼠主动脉,4%多聚甲醛固定并进行冰冻切片,采用免疫组织化学方法检测Siglec-E配体在血管组织中的表达分布,以单独二抗处理作为阴性对照. 1.2.获取Balbc小鼠的主动脉总蛋白,采用Western Blot检测Siglec-E配体的表达,以单独二抗、唾液酸酶(80U/L)处理作为阴性对照. 1.3.提取Balbc小鼠的主动脉总蛋白,采用免疫共沉淀法联合质谱法鉴定该配体可能的蛋白载体. 2.炎症等危险因素对血管内皮细胞Siglec-E配体表达的影响 2.1.培养原代小鼠主动脉内皮细胞,分组并给予以下处理:对照组、衣霉素组(0.1μM)、Swainsonine组(20μM)、Benzyl-α-GalNAc组(2 mM),刺激24 h后,提取细胞总蛋白,Western Blot检测Siglec-E配体表达水平,初步推断其聚糖类型. 2.2.将原代小鼠主动脉内皮细胞按以下分组并处理:对照组、甘露糖组(8 g/L)、葡萄糖组(8 g/L)、半乳糖组(8 g/L)、N-乙酰半乳糖胺(8 g/L)、N-乙酰葡萄糖胺(8 g/L)、LPS(100 ng/mL)、ox-LDL(100μg/mL,MDA30μM),刺激24 h后,提取蛋白,Western Blot检测Siglec-E配体表达水平. 2.3.原代小鼠主动脉内皮细胞分组并给予以下处理:对照组、LPS组(300 ng/mL)、LPS+TPCK组(300 ng/mL LPS+20μM TPCK)、LPS+Thiamet G组(300 ng/mL LPS+20μM Thiamet G)、LPS+Decitabine组(300 ng/mLLPS+10μMDecitabine)、LPS+Bay11-7082组(300 ng/mL LPS+2μM Bay11-7082),刺激24 h后,提取总蛋白,Western Blot检测Siglec-E配体表达水平及p-p65 NF-κB的表达水平. 2.4.培养原代小鼠主动脉内皮细胞,分组并给予以下处理:对照组、LPS组(300 ng/mL)、NF-κB p65 siRNA组(50 nM siRNA)、LPS+NF-κB p65 siRNA组(300 ng/mL LPS+50 nM siRNA)、LPS+Vehicle组,提取总蛋白,Western Blot检测Siglec-E配体表达水平及p-p65 NF-κB的表达水平. 2.5.将原代小鼠主动脉内皮细胞按以下分组处理:对照组、LPS组(300 ng/mL)、LPS+TPCK组(300ng/mL LPS+20μM TPCK),刺激24h后,再与RAW264.7细胞与共培养24 h,用流式细胞仪检测巨噬细胞的吞噬以及凋亡情况. 3.炎症等危险因素对小鼠主动脉Siglec-E配体表达的影响 3.1.实验动物及处理:SPF级Balbc雄性小鼠,6周龄,随机分成6组.对照组:隔天腹腔注射等体积的PBS,基础饲料饲养;低剂量LPS组:隔天腹腔注射LPS(0.5 mg/kg),基础饲料饲养;高剂量LPS组:隔天腹腔注射LPS(2 mg/kg),基础饲料饲养;LPS+TPCK组:隔天腹腔注射LPS(2 mg/kg)与TPCK(3 mg/kg),基础饲料饲养;高糖组:隔天腹腔注射等体积的PBS,高糖饲料(80%基础饲料+20%葡萄糖)饲养;高脂组:隔天腹腔注射等体积的PBS,高脂饲料(95%基础饲料+5%猪油)饲养.各组动物自由饮食,记录动物体重,给药两周后麻醉脱颈椎处死动物取样. 3.2.小鼠眼眶取血,检测血糖水平及血常规,取上清检测TC、TG、LDL、HDL、IL-6、TNF-α、IL-1β的水平. 3.3.主动脉Siglec-E配体的表达水平:将主动脉固定后进行冰冻切片,免疫荧光染色检测配体的表达变化;并提取各组小鼠主动脉总蛋白,Western Blot检测Siglec-E配体及p-p65 NF-κB的表达水平. 4.CompoundK对内皮细胞Siglec-E配体的表达影响 4.1.原代小鼠主动脉内皮细胞按以下分组处理:Control组、LPS组(300 ng/mL)、CK低剂量组(3μM)、CK中剂量组(10μM)、CK高剂量组(30μM)、LPS+CK低剂量(300 ng/mL LPS+3μM CK)、LPS+中剂量CK组(300 ng/mL LPS+10μM CK)、LPS+高剂量CK组(300 ng/mL LPS+30μM CK),刺激24h后,提取细胞总蛋白,采用Western Blot检测Siglec-E配体的表达水平. 4.2.将原代小鼠主动脉内皮细胞按以下分组处理:Control组,LPS组(300 ng/mL)、LPS+CK组(300 ng/mL LPS+30μM CK)、LPS+GW3965组(300 ng/mL LPS+10μM GW3965)、LPS+Atorvastatin组(300 ng/mL LPS+10μM Atorvastatin)、LPS+CK+GGPP组(300 ng/mL LPS+30μM CK+10μMGGPP)、刺激24h后,提取总蛋白,采用Western Blot检测Siglec-E配体及p-p65 NF-κB的表达水平. 结果: 1.小鼠主动脉Siglec-E配体的鉴定: Siglec-E配体广泛分布在小鼠主动脉中,集中分布在内膜与中膜,且为唾液酸依赖性. 2.炎症等危险因素对血管内皮细胞Siglec-E配体表达的影响 2.1.小鼠主动脉内皮细胞的Siglec-E配体为唾液酸依赖性的O-连接糖蛋白. 2.2.与对照组相比,LPS组、葡萄糖组、半乳糖组、N-乙酰半乳糖胺组、N-乙酰葡萄糖胺组内皮细胞Siglec-E配体的表达明显增多(P＜0.05);甘露糖组和ox-LDL组表达与对照组相比无显著性差异. 2.3.LPS刺激对Siglec-E配体表达的影响具有时间及剂量依赖性. 2.4.TPCK和Bay的处理能够显著降低LPS导致的Siglec-E配体表达增高(P＜0.05);与LPS组比较LPS+Decitabine组和LPS+Thiamet G组均无显著差异.与对照组比较，LPS组p-p65 NF-κB表达显著增多(P＜0.05);与LPS组比较,LPS+TPCK组和LPS+Bay11-7082组的p-p65 NF-κB表达显著减少(P＜0.05),提示LPS引起的配体表达增加与NF-κB通路相关. 2.5.与Control组比较,LPS组p-p65 NF-κB的水平显著性增加,LPS+NF-κB p65 siRNA转染后明显降低了p-p65 NF-κB的水平(P＜0.05).与LPS组相比,LPS+NF-κB p65 siRNA组Siglec-E配体的表达水平显著性下降(P＜0.05). 2.6.由LPS诱导的内皮细胞Siglec-E配体表达水平增加,可显著增加共培养的巨噬细胞的凋亡水平,降低其吞噬能力. 3.炎症等危险因素对小鼠主动脉Siglec-E配体表达的影响 3.1.与对照组相比,高剂量LPS组小鼠的体重显著性下降(P＜0.05),其它组小鼠体重无显著性差异. 3.2.与对照组比较,高糖组小鼠血糖值显著性增高(P＜0.05). 3.3.与对照组相比,低剂量LPS组、高剂量LPS组、高糖组和高脂组小鼠主动脉Siglec-E配体的表达水平均显著性上调;与高剂量LPS组比较,LPS+TPCK组Siglec-E配体的表达水平显著性下降;与对照组比较,高剂量LPS组主动脉p-p65 NF-κB的表达显著性增加(P＜0.05);TPCK明显下调其p-p65 NF-κB的表达水平. 4. CK对内皮细胞Siglec-E配体的表达影响 4.1.与对照组相比,CK能够剂量依赖性地增加Siglec-E配体的表达(P＜0.05). 4.2.与LPS组比较，LPS+CK组Siglec-E配体的表达均显著性上调（P＜0.05)，LPS+GW3965组和LPS+Atorvastatin组表达无显著性差异. 4.3.LPS组较对照组p-p65 NF-κB的表达显著增加;LPS+CK组和LPS+GW3965组能够显著抑制p-p65 NF-κB的表达(P＜0.05);但GW3965组Siglec-E配体表达与LPS组比较无显著性差异.与LPS+CK组相比,LPS+CK+GGPP组p-p65 NF-κB的表达显著性升高,但是Siglec-E配体的表达无显著性差异. 结论: 1. Balbc小鼠主动脉及原代培养的内皮细胞存在Siglec-E配体的表达. 2.该配体为O连接的唾液酸依赖性糖蛋白. 3. LPS和高葡萄糖在体内外均能增高Siglec-E配体的表达. 4. LPS增加Siglec-E配体的表达与激活NF-κB通路相关. 5.Compound K升高Siglec-E配体的表达可能为其抗动脉粥样硬化作用的新机制.