肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，由于其恶性程度高，易转移、复发，严重危害人类的健康。近几年对肝癌的临床研究虽然有深入，但现有肝癌治疗方法的效果仍欠佳。对于不能手术的中晚期肝癌患者一般会采用化疗，通过现有已知的化疗机制未能有效地杀伤肝癌中的肿瘤干细胞可能是肝癌化疗效果差，复发率高，预后不良的根源所在。此外，还有放疗、免疫治疗和姑息性治疗等措施。即便有这么多的治疗措施，肝癌的治疗效果也不令人满意，因此寻找有效的新的治疗方法十分必要。与普通肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞表现出抗凋亡和极强的耐药性等特点。越来越多的证据表明肿瘤干细胞与肿瘤的发生发展、转移复发及放化疗抵抗密切相关。肝癌是一种高代谢的肿瘤，耗氧量明显高于正常的组织，而且肿瘤内部血管结构和功能异常可以导致肿瘤细胞的氧供减少，故肝癌组织一直处于一种低氧的肿瘤微环境。在肝癌的发生发展过程中，血管生成的速度不能满足肿瘤对血供的需要，因此肿瘤细胞处于缺营养的状态。肿瘤干细胞要具有突破缺血缺营养的能力才能得以存活以致进一步形成肿瘤。因此,我们有必要深入研究肝癌干细胞适应缺血缺营养肿瘤微环境形成肝癌的具体机制,并为肝癌有效的临床治疗提供理论依据。自噬是近些年来一直广受关注的一种细胞应激反应，是细胞应对恶劣微环境的一种生存机制，而且营养缺乏和低氧是自噬的典型诱导因素。当营养缺乏时，细胞通过自噬利用溶酶体对细胞内受损伤的细胞器和大分子进行降解，从而维持蛋白质的代谢平衡及细胞内环境稳定，提供可以维持细胞生存所需要的最低能量。因此，细胞处于不利环境时，自噬可作为一种保护机制。因此推测肿瘤干细胞可能通过调节自噬来耐受缺血缺氧的肿瘤微环境来继续生存。研究自噬在肝癌干细胞适应缺血缺氧肿瘤微环境中的作用，对于进一步理解肝癌的发生发展、转移复发，探索特异性的肝癌治疗方法具有重要意义。有研究显示自噬、肿瘤干细胞与肿瘤的发生发展密切相关，肿瘤干细胞被人们认为是肿瘤的根源，近些年来一些研究发现肿瘤干细胞能够耐受缺血缺氧的肿瘤微环境，但其机制尚不明确。前期研究提示自噬在肿瘤干细胞耐受缺血缺氧微环境中起重要作用。本课题从以下三个方面进行研究：第一部分在缺血缺氧的肿瘤微环境中CD133+和CD133-肝癌细胞的耐受能力差异的观察；第二部分自噬对CD133+肝癌干细胞耐受缺血缺氧肿瘤微环境的作用及机制研究；第三部分自噬对CD133+肝癌细胞的干性维持及裸鼠成瘤作用的研究。第一部分在缺氧缺营养的肿瘤微环境中CD133+和CD133-肝癌细胞耐受能力差异的观察首先，选CD133阳性表达高的Huh7肝癌细胞系，经8小时低氧处理后16小时的缺营养缺氧处理来模拟肿瘤微环境，经免疫荧光染色和流式检测发现CD133+细胞比例明显增加，存活率更高。其次根据以上实验结果，选用流式细胞仪对Huh7肝癌细胞系进行流式分选，得到CD133+和CD133-的Huh7肝癌细胞，经8小时低氧处理后16小时的缺营养缺氧处理后通过光镜观察和DAPI染色从形态学上来观察细胞凋亡差异，通过CCK8实验来检测细胞的生存能力差异，通过PI-AnnexinV双染用流式细胞仪来定量的检测细胞凋亡差异，最后经克隆形成实验比较二者的克隆增殖能力，从而探讨在缺营养缺氧的肿瘤微环境中CD133+和CD133-肝癌细胞的耐受能力差异。形态学观察，增殖力检测试验和流式细胞仪对细胞凋亡的定量分析及克隆形成实验均显示，与CD133-的Huh7肝癌细胞相比，CD133+的肝癌细胞有更强的生存能力和克隆增殖能力，能更好的耐受缺营养缺氧的恶劣肿瘤微环境。第二部分自噬对CD133+肝癌干细胞耐受缺氧缺营养肿瘤微环境的作用及机制研究本部分实验拟从细胞分子水平探讨CD133+肝癌干细胞是通过哪种机制耐受缺血缺氧恶劣的肿瘤微环境的。有研究显示，自噬能提高细胞在恶劣环境中的生存能力，于是我们将流式分选得到CD133+和CD133-的Huh7肝癌细胞，经8小时低氧处理后16小时的缺营养缺氧处理后，用RT-PCR和Western Blot检测二者处理前后自噬相关基因Beclin1, Atg7, Atg5, and LC3的表达和蛋白水平的变化和差异，发现CD133+的Huh7肝癌细胞有更高的基础水平的自噬，而且经处理诱导自噬后，自噬变化更大，表达水平更高。同时向肝癌细胞中转染可以表达自噬标志性分子LC3的质粒—GFP-LC3，然后分别置于正常培养基和缺营养缺氧处理后，荧光显微镜下观察GFP-LC3的表达情况来间接的检测自噬发生情况；同样电镜的观察也得到了相似的结果，表明CD133+比CD133-的Huh7肝癌细胞有更高的自噬水平。为了进一步明确自噬是否参与了CD133+的肝癌干细胞对缺血缺氧肿瘤微环境的抵抗，我们还采用了自噬抑制剂CQ，使其作用于肝癌细胞，然后检测自噬被CQ抑制后CD133+和CD133-的Huh7肝癌细胞的生存和凋亡差异改变，从而探讨自噬可以作为CD133+肝癌干细胞耐受缺血缺氧恶劣的肿瘤微环境的作用机制。首先验证了自噬抑制剂——CQ可以有效地抑制肝癌细胞的自噬，再使CQ作用于肝癌细胞抑制自噬，经8小时低氧处理后16小时的缺营养缺氧处理后，发现CD133-和CD133+的Huh7肝癌细胞的生存能力和克隆增殖能力差异明显缩小，说明自噬作为CD133+肝癌干细胞耐受缺血缺氧恶劣的肿瘤微环境的作用机制，对CD133+肝癌干细胞起保护作用，抵抗凋亡。第三部分自噬对CD133+肝癌干细胞在缺氧缺营养肿瘤微环境中自我更新及成瘤作用的研究上述实验已证实自噬作为CD133+肝癌干细胞的保护机制使其耐受缺血缺氧恶劣的肿瘤微环境抵抗凋亡。那么自噬对CD133+肝癌细胞的干性及裸鼠成瘤又发挥着怎样的作用呢？通过实验发现，Huh7肝癌细胞经8小时缺营养缺氧处理后进行悬浮培养，细胞的成球能力得到提高，CQ抑制自噬后成球能力下降，究竟是哪群细胞在悬浮培养成球中发挥着主要作用？我们将分选得到的CD133-和CD133+的Huh7肝癌细胞进行上述实验，发现CD133+的Huh7肝癌细胞也有上述结果，与之相比，CD133-的Huh7肝癌细胞由于悬浮培养成球数很少，没有统计学意义，上述结果提示，自噬对CD133+肝癌细胞具有干性维持作用。进行体外实验后，我们采用裸鼠种植瘤模型进行体内实验，通过磁珠对Huh7肝癌细胞系进行分选，得到CD133+和CD133-的Huh7肝癌细胞分别注入小鼠体内，建立裸鼠Huh7细胞种植瘤模型，之后观察CD133+和CD133-的Huh7肝癌细胞单独应用和联合使用CQ（体内自噬抑制剂）对肿瘤疗效的影响。实验结果显示CD133+的Huh7肝癌细胞在裸鼠体内有更强的成瘤能力，而且自噬抑制剂CQ可以起到很好的抑制肿瘤的效果，与单独的处理组相比较，肿瘤无论在体积还是重量上都有着明显的降低。以上结果表明：自噬对CD133+肝癌细胞的干性具有维持作用，而且对于肝癌种植瘤，自噬使CD133+的肝癌细胞有更强的成瘤能力。综上所述，我们的研究结果提示以下结论：1、在缺血缺氧的肿瘤微环境中CD133+比CD133-的肝癌细胞耐受能力更好，能更好的抵抗凋亡，有更强的生存能力和克隆增殖能力。2、无论在正常情况还是缺血缺氧的肿瘤微环境中，CD133+比CD133-的Huh7肝癌细胞有更高的自噬水平（自噬相关基因Beclin1, Atg7, Atg5, and LC3的表达），抑制自噬后，二者生存能力差异明显减弱，说明自噬在CD133+肝癌干细胞耐受缺血缺氧肿瘤微环境中发挥着重要的作用。3、通过悬浮球培养实验和裸鼠种植瘤模型提示自噬对CD133+肝癌干细胞的干性具有维持作用而且使CD133+的肝癌细胞有更强的成瘤能力。