目的:目前肺癌的发病率和死亡率仍然居高不下,给人类的生命健康造成了巨大的威胁。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,这其中非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）占80%左右。虽然其治疗手段多种多样,包括手术治疗、放疗、化疗和新辅助治疗等,但探究更加精准的治疗仍然是必须的。TBC1D23是TBC/RABGAP家族成员,具有两个结构域,一个是TBC结构域,一个是Rhodanese结构域。结合之前的报道,TBC1D23在细胞内的物质转运方面发挥的强大作用,和物质转运在肿瘤中的重要地位,本研究探究了 TBC1D23通过其对物质转运的调节作用,进而对非小细胞肺癌发生的影响。RAB11A是RAB小GTP酶家族成员。RAB11A在物质转运方面发挥了非常重要的作用。其中RAB11A介导整合素经过内循环回到细胞膜上循环利用的作用值得注意。整合素作为跨膜受体家族的一员,在细胞粘附方面至关重要。并且其与配体结合内吞后,通过与FAK结合启动了 FAK的自磷酸化,进而启动下游一系列信号转导通路,调节肿瘤的发生和发展。本研究主要目的在于确定TBC1D23与非小细胞肺癌之间的关系以及作用机制,为治疗非小细胞肺癌提供新的思路和方向。研究方法:1、免疫组织化学实验检测了随机选取的173例非小细胞肺癌石蜡标本中TBC1D23的染色情况。检测了 28例非小细胞肺癌石蜡标本的连续两张切片中TBC1D23和β1整合素的染色情况。这些患者在手术前均未接受过化学药物治疗和放射治疗。在统计分析时,每张切片的染色情况根据染色程度和面积进行赋值,之后相乘得到每张切片的总得分。染色程度分为:0分（未着色）,1分（淡黄色）,2分（黄色）,3分（深棕色）。染色面积分为:1分（1%-25%）,2分（26%-50%）,3分（51%-75%）,4分（76%-100%）。这样每张切片的总得分在0分到12分之间。本研究将6分作为界限,即≥6分为阳性;＜6分为阴性。本研究分析了 TBC1D23的表达与非小细胞肺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分型、分化程度、淋巴结转移情况和TNM分期情况之间的关系。本研究也分析了 TBC1D23与β1整合素的表达间的关系。2、免疫印迹实验检测了15对配对非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织中TBC1D23的蛋白表达情况。其中β-actin作为内参。检测了 HBE、H1299、A549、H460、H661、SK-MES-1、H226和H292细胞中TBC1D23的蛋白表达情况。检测了 TBC1D23对CyclinB1、CyclinD1、CDK2、CDK6、CDK1、RhoA、RhoC、MMP2、RAB11A、β1整合素、FAK、MEK和ERK的蛋白表达情况的影响,以及对FAK、MEK、ERK、JNK和p38的磷酸化水平的影响。其中GAPDH作为内参。首先将蛋白样加入到SDS-PAGE胶的泳道中,组装电泳槽进行蛋白凝胶电泳。然后使用转印装置和PVDF膜进行转印,之后在PVDF膜上滴加一抗进行孵育。第二天根据一抗的不同属性,向PVDF膜上滴加山羊抗小鼠或山羊抗兔的二抗进行孵育。最后PVDF膜经过清洗后滴加ECL发光液进行发光。3、定量聚合酶链反应实验（Real-Time PCR）检测了 12对配对非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织中TBC1D23的mRNA表达情况。也检测了 TBC1D23对β1整合素的mRNA表达水平的影响。其中β-actin作为内参。经过RNA提取、RNA反转录后即可进行Real-Time PCR实验。RNA反转录的反应条件为:37℃/15分钟,85℃/5秒,4℃保存。Real-Time PCR的反应条件为:95℃/30秒,95℃/5秒持续40个循环,60℃/30 秒。4、细胞免疫荧光实验检测了 TBC1D23 在 A549、H1299、SK-MES-1、H460 和 H292细胞中的定位情况。也检测了 TBC1D23和RAB11A在细胞中的共定位情况。同时也检测了 TBC1D23对RAB11A和β1整合素在核旁共定位的影响。进行实验时,使用2%的多聚甲醛固定、Triton X100给细胞打孔、5%BSA封闭后加入一抗,孵育过夜。第二天根据一抗的属性加入FITC或TRITC标记的二抗进行孵育。最后在细胞爬片上滴加DAPI染料对细胞核进行染色。当检测共定位情况的实验时,在孵育完对应第一个一抗的荧光二抗后,清洗后孵育第二个一抗。第三天孵育完对应第二个一抗的二抗后再对细胞核进行染色。5、使用1640培养基培养A549、H1299、H460、H661、H226和H292细胞;使用MEM培养基培养SK-MES-1细胞;使用DMEM培养基培养HBE细胞。培养基中均含有10%的胎牛血清。所有细胞均在环境设置为37℃的含有5%二氧化碳的敷箱中培养。使用Lipo 3000转染试剂盒进行瞬时转染。质粒使用的是pcDNA3.0-myc（p-NC）、pcDNA3.0-TBC1D23-myc（p-TBC1D23,WT）和突变体△TBC。小干扰RNA使用的是NC（si-NC）、si-TBC1D23和si-RAB11A。转染后6小时更换培养基,24小时收集细胞提取RNA,48小时收集细胞提取蛋白。Lipo 3000和G418用来进行稳定转染。在六孔板中铺满六个孔的细胞,其中一个孔的细胞作为对照组不进行转染,所有6个孔的细胞中每天都加入G418。对照组的细胞全部死亡后,将其余五个孔中的细胞收集起来放在细胞培养瓶中进行培养。使用Nocodazole药物（NZ）对整合素进行同步化,使其停留在细胞膜上。加入NZ药物后4小时为0时间点。6、细胞增殖分析检测了非小细胞肺癌细胞的增殖能力。在96孔板的每个孔中加入100μl培养基,并保证每个孔中包含的细胞数量相同。每个细胞样本制备5个复孔。在检测时,首先加入按照9:1的配比配制的无血清培养基和MTT试剂混合液。4个小时后弃掉每个孔中的液体,并加入100μl的DMSO。混匀后使用酶标仪进行检测,检测时激发光波长为490nm。连续检测5天,并且5天的检测时间都相同。7、平板克隆形成分析检测了非小细胞肺癌细胞的集落形成能力。在6孔板的每个孔中加入4ml培养基,并保证每个孔中的细胞数量为500个。将细胞培养板放在敷箱中培养若干天后进行检测。在检测时,首先使用事先已经预冷的甲醇溶液固定,之后加入结晶紫进行染色。最后使用发光仪采集图像。8、细胞周期实验检测了 TBC1D23对非小细胞肺癌细胞周期进程的影响。首先将细胞保存在70%的酒精中过夜。第二天将PI和RNase A混合后加入到细胞中。在避光的条件下作用30分钟后,用流式细胞仪检测实验结果。9、细胞划痕实验检测了非小细胞肺癌细胞的迁移能力。首先向培养基中加入丝裂霉素作用2小时。之后用100μ1枪头小心地在六孔板中纵横方向各画两条直线,此时即为0时间点。在倒置显微镜下采集图像。之后分别在12小时和24小时使用倒置显微镜观察细胞间空隙的大小并采集图像。10、细胞迁移和侵袭实验检测了非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力。如果检测的是细胞侵袭能力,则在前一天在Transwell小室的上室中提前加入100μl基质胶。接种细胞时,小室的上室中加入200μl含有2%血清的细胞悬液,并且对照组和实验组中细胞数量相同;下室中加入600μl含有20%血清的细胞培养基。放置在敷箱中培养24小时进行染色。首先使用事先已经预冷的甲醇溶液固定,之后加入结晶紫进行染色。最后使用正置显微镜采集图像。11、裸鼠皮下成瘤实验检测了 TBC1D23对非小细胞肺癌恶性进展的影响。注射进裸鼠体内的细胞数量为106个,这些细胞浓缩在200μl的无血清培养基中。每星期观察小鼠的状态。4周后收集小鼠,从小鼠体内剖离出肿瘤进行测量。12、质谱分析检测了有可能与TBC1D23相互作用的蛋白。蛋白质免疫共沉淀实验验证了质谱分析的结果,检测了 RAB2A、RAB5C和RAB11A与TBC1D23之间的结合情况。首先使用NP40和PMSF按照100:1的配比配制而成的裂解液裂解细胞,离心后保留上清液。之后向上清液中加入80μl的磁珠进行封闭。再次离心后取上清液测量蛋白浓度,根据蛋白浓度加入抗体。孵育过夜后加入25μl的磁珠。6小时后即可清洗磁珠,加入2×loadingbuffer并在沸水中加热变性后进行蛋白质免疫印迹实验。如进行质谱分析,则只进行到凝胶电泳结束即可。13、流式细胞术实验检测了不同时间点细胞膜上的β1整合素的量。首先向细胞中加入FITC标记的β1整合素抗体,之后加入2%的多聚甲醛固定,最后用PBS洗去多聚甲醛后即可使用流式细胞仪检测实验结果。14、免疫组织化学的实验结果是使用SPSS v 18.0系统进行χ2检验统计。其余实验结果是使用GraphPad Prism 5系统进行t检验统计。实验重复三次进行。P＜0.05被视为具有统计学意义。结果:1、173例非小细胞肺癌石蜡标本进行免疫组织化学实验显示,TBC1D23在癌组织中的表达高于正常组织。并且TBC1D23的高表达与肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移情况和TNM分期相关。15对配对非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织进行蛋白质免疫印迹结果显示,TBC1D23的蛋白表达量在癌组织中更高。12对配对非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织进行Real-TimePCR结果显示,TBC1D23 mRNA表达量在癌组织中更高。Human ProteinAtlas数据库对494例非小细胞肺癌患者的分析结果显示,TBC1D23的高表达与非小细胞肺癌的不良预后相关。证明了TBC1D23可能作为治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点。2、免疫组织化学实验结果和细胞免疫荧光实验结果显示,TBC1D23主要定位于细胞浆。3、对HBE、H1299、A549、H460、H661、SK-MES-1、H226和H292细胞进行的蛋白质免疫印迹结果显示,TBC1D23在H1299细胞中呈低表达,在SK-MES-1细胞中呈高表达,在A549细胞中呈中等表达。4、MTT和集落形成实验结果显示,TBC1D23能够促进非小细胞肺癌细胞的增殖能力。细胞周期实验结果显示,TBC1D23能够促进非小细胞肺癌细胞由G1期向S期转变。蛋白质免疫印迹实验结果显示,TBC1D23能够促进非小细胞肺癌细胞中CyclinB1、CyclinD1、CDK2和CDK6的蛋白表达。5、细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,TBC1D23能够促进非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力。蛋白质免疫印迹实验结果显示,TBC1D23能够促进非小细胞肺癌细胞中RhoA、RhoC和MMP2的蛋白表达。6、裸鼠皮下成瘤实验结果显示,TBC1D23能够促进非小细胞肺癌的恶性进展,在体内实验中证明了 TBC1D23可能作为治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点。7、质谱分析实验结果显示,TBC1D23有可能与RAB2A、RAB5C和RAB11A相互作用。蛋白质免疫共沉淀实验结果显示,TBC1D23能与RAB11A发生相互作用。并且蛋白质免疫印迹实验结果显示,TBC1D23不能影响RAB11A的蛋白表达水平。细胞免疫荧光实验结果显示,TBC1D23和RAB11A在核周发生共定位。8、在非小细胞肺癌细胞中同时过表达TBC1D23和敲减RAB11A,通过MTT实验、集落形成实验、细胞划痕实验和Transwell实验,发现TBC1D23与RAB11A相互作用促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过蛋白质免疫印迹实验发现TBC1D23 与 RAB11A 相互作用,进而促进 CyclinB1、CyclinD1、CDK2、CDK6、RhoA、RhoC和MMP2的蛋白表达。同时也显示,TBC1D23与RAB11A相互作用后,激活β1整合素/FAK/ERK信号转导通路。9、构建TBC结构域缺失的突变体△TBC,蛋白质免疫共沉淀实验结果显示,TBC1D23通过TBC结构域与RAB11A相互作用。MTT实验、集落形成实验、细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,TBC1D23通过TBC结构域促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。蛋白质免疫印迹实验结果显示,TBC1D23通过TBC结构域促进相关功能蛋白的表达,并激活β1整合素/FAK/ERK信号转导通路。10、RT-PCR实验结果显示,TBC1D23不影响β1整合素的mRNA的表达量。NZ洗脱系统中进行的流式细胞术实验和细胞免疫荧光实验结果显示,TBC1D23参与RAB11A与β1整合素在核旁的相互作用。11、28例同一非小细胞肺癌组织蜡块的连续两张切片的免疫组织化学实验结果显示,TBC1D23与β1整合素的表达正相关。结论:1、TBC1D23促进非小细胞肺癌恶性进展,与其不良预后相关。2、TBC1D23通过TBC结构域与RAB11A相互作用,激活β1整合素/FAK/ERK信号转导通路。3、TBC1D23参与RAB11A与β1整合素在核旁的相互作用。