研究背景：1969年Ingram和Cooper smith在对失血性Beagle犬的外周血经新亚甲蓝染色的镜检中，观察到部分清晰的浓染网状结构的血小板，被命名为网织血小板(Reticulated platelet，简称RP)。网织血小板是由骨髓巨核细胞新近释放入外周血的血小板，不含核或DNA成分，却含有少量的mRNA和粗面内质网，保留了合成少量蛋白质的能力，它反映了循环中最年轻的血小板。近年来，随着网织血小板检测方法的不断改进，流式细胞仪和网织细胞检测仪在临床上的广泛应用，使其在机体造血功能中的临床意义的得以深入研究，成为分析血小板的生成状态的有用指标。但是由于目前国内外网织血小板检测的方法还未统一，检测过程复杂，参考值也有较大的差异，临床应用受到了一定的限制。目的：在上述研究背景下，我们通过实验设计来探讨以下几个问题：1．应用流式细胞技术检测网织血小板的方法。在现有流式细胞技术基础上，比较全血和血浆标本检测网织血小板的差异，并对检测方法进行改进，确定噻唑橙检测网织血小板的最佳条件，简化检测方法。2．确定流式细胞技术检测网织血小板的正常人群的参考值，比较男性和女性参考值差异性。3．对网织血小板与血小板相关参数(平均血小板体积MPV、血小板分布宽PDW、大血小板比例P-LCR)结果之间的关系进行探讨。4．初步探讨网织血小板在血小板减少性疾病鉴别诊断中的临床意义，通过网织血小板的检测，区分不同病因引起的血小板减少性疾病，从而进行病因分析。方法：1．探讨流式细胞仪检测网织血小板的方法；探讨流式细胞仪检测RP的方法，并对网织血小板的检测方法进行改进，通过析因设计的方差分析确定噻唑橙检测网织血小板的最适合的检测条件，用CD42b-PE单抗标记血浆及全血中的血小板，再用荧光染料噻唑橙(thiazol orange，TO)染色网织血小板内RNA。以流式细胞仪对RP百分率进行检测。分别对全血及血浆样本在不同TO浓度及孵育时间下的网织血小板进行测定，确定网织血小板测定的最佳TO浓度及孵育时间。在一定检测条件下，比较全血和血浆检测网织血小板的差异。对一样本进行10次连续性测定，检测其CV值，验证该方法的重复性。2．确定网织血小板的正常参考值；以100例健康人做为正常对照组(其中男性50例，女性50例)，对正常对照组的RP百分率及RP绝对值进行检测。并对结果进行统计学分析，从而对男性和女性的结果差异进行比较。3．对RP百分比与血小板相关参数(MPV、PDWP-LCR)的结果之间的关系进行分析：通过对147例样本的网织血小板与MPV、PDW、P-LCR的检测结果进行相关分析，比较他们的相关性。并将MPV＞11.0fl组的RP％与正MPV＜11.0fl组进行比较，比较两者的差异性。4．初步探讨网织血小板对血小板减少性疾病的鉴别诊断的临床意义；对不同原因造成的血小板减少的病人进行网织血小板测定，继而对血小板减少的原因进行分析，从中找出网织血小板对血小板减少性疾病的鉴别诊断价值。入选病例为特发性血小板减少性紫瘢(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)12例、再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)12例、急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)36例、急性非淋巴细胞白血病(acute non-lymphocytic leukemia，ANLL)30例、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)5例、慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)8例。对这些病人的血小板总数及网织血小板百分比及绝对值进行测定，对男性与女性结果进行分组与正常对照组结果进行比较。对不同类型血液疾病的网织血小板结果进行分析，对网织血小板反映骨髓血小板生成状况的情况进行评估。结果：1．我们通过析因设计的方差分析，发现流式细胞仪测定RP的结果受到TO浓度及孵育时间的影响，随着TO浓度的提高及孵育时间的延长RP的结果呈现明显的上升趋势。通过析因设计的方差分析表明在TO1：2稀释的条件下60min与90min时间段内RP％检测结果差异较其它组小，因而选择TO1：2稀释条件下孵育60min作为测定时条件，实验条件相对较容易控制。在该条件下能够较好的区分网织血小板，且结果稳定；并且对比了18例血浆和全血的检测结果，相关系数0.997，二者显著相关，并对二者结果进行成对样本的t检验，P＞0.05，二者无显著性差异，该方法重复性CV％为1.32％，重复性好，因而适合于临床检测网织血小板。2．检测了100例健康人RP％，结果为：9.72％±2.59％(X±SD)，其中男性50例，RP％为9.15％±2.01％，女性50例，RP％为10.29％±2.97％。女性的结果高于男性，P＜0.05，男女间差异具有统计学意义。用血小板总数乘以网织血小板百分比可得于网织血小板绝对值，100例正常人的网织血小板绝对值(RP)为：21.29±6.75(×10~9／L)，其中男性50例，RP为19.46±5.52(×10~9／L)，女性50例，RP为23.13±7.39(×10~9／L)。女性的结果高于男性，P＜0.05，男女间差异具有统计学意义。3．通过对147例标本(男性组72例、女性组75例)同时检测RP％及MPV、PDW、P-LCR，RP％与MPV的检测结果进行相关分析，男性组：γ=0.407，P＜0.001，女性组：γ=0.452，P＜0.001，RP％与MPV之间呈正相关关系。在MPV≥11.0fl组的RP％为13.63％±6.15％，MPV＜11.0fl组的RP％为9.80％±4.56％，P=0.001，二者具有显著性差异。RP％与PDW及P-LCR也均呈现相关关系。4．12例ITP病人RP％测量结果为28.87％±8.91％(范围从15.16％-44.98％)，明显高于正常对照组，4例治疗后的ITP病人RP％为9.06％±3.87％，与正常对照组无差异；12例AA的RP％为5.96％±3.01％(范围从2.50％-14.49％)，低于正常对照组，RP绝对值为1.57±1.90(×10~9／L)，结果明显低于正常对照组。36例ALL组RP％为12.20％±5.33％，30例ANLL组RP％为10.83％±5.16％，与正常对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)；8例慢性粒细胞白血病RP绝对值为：139.67±80.06(×10~9／L)，RP绝对值明显高于正常对照组(P=0.000)。5例MDS病人RP％为21.75％±7.37％，高于正常对照组(P＜0.05)。5．RP％与骨髓巨核细胞相关性分析：分析了6例病人骨髓巨核细胞检测结果，并与RP％结果进行了对照分析，发现6例病人的网织血小板的检查结果与骨髓巨核细胞检查结果相符。结论：1．应用流式细胞技术检测外周血网织血小板的最佳TO浓度为1：2稀释、染色时间为60分钟，此时能够较好的区分网织血小板，且实验条件容易控制，适合于临床检测。2．在以上条件下，使用全血和富血小板血浆检测结果接近，二者均适合于流式细胞技术常规检测网织血小板。使用全血作为检测物可以简化实验步骤，减少操作过程对检测结果的干扰。3．正常对照组男性网织血小板值低于女性，二者间数值差异具有统计学意义。4．MPV、PDW和P-LCR与RP％有一定的相关关系，MPV高于11.0fl组RP％高于MPV小于11.0fl组，提示血小板体积增大的病人RP％增高。5．RP％在不同血液疾病中的测定结果显示RP％对于血小板减少性疾病的病因诊断有一定参考价值，ITP病人RP％显著增高，而AA病人RP绝对值减低，CML病人RP绝对值显著增加，其结果与骨髓巨核细胞的数量具有一定的相关性，通过RP％的检测，可以间接的判断骨髓巨核细胞的生成状况，从而对血小板减少的原因进行分析。本研究的主要创新点：1．在国内首先采用CD42b-PE单抗与TO双标记检测全血中网织血小板，改进了流式细胞技术检测网织血小板的方法。探讨了全血标本检测网织血小板的条件，简化了检测步骤。2．建立正常人群全血标本网织血小板的参考值。3．通过对RP％与P-LCR进行比较，找出了两者之间的相关性。4．首次在国内报道了RP％直接与骨髓巨核细胞数量的研究结果，为骨髓造血功能的测定提供了一个较简便的临床应用指标。5．观察了RP和RP％在ITP病人组、AA病人组和CML病人组中测定结果，对不同血液疾病造成血小板减少病因诊断有一定参考价值。