人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，RSV)是一种非节段性、单股负链RNA包膜病毒，属于肺病毒科。RSV是导致婴幼儿和老年人呼吸道疾病的主要病毒病原，每年造成3千多万5岁以下儿童严重下呼吸道感染、6万多名儿童死亡。RSV被发现至今已有60多年，但到目前为止，仍然没有一种可用于预防病毒感染的有效疫苗。二十世纪六十年代，福尔马林灭活的病毒(formalin-inactivated RSV,FI-RSV)辅以铝佐剂的疫苗首先被用于婴幼儿RSV疫苗的研究。不幸的是，这种疫苗导致了接种婴幼儿严重的呼吸道疾病增强作用(enhanced respiratory disease，ERD)及极高的住院率，两名儿童因细支气管单核细胞浸润和嗜酸性粒细胞增多而死亡。FI-RSV导致ERD的原因有两个，一方面是中和抗体活性偏低，不能有效中和病毒;另一方面是疫苗诱导的Th2偏向的免疫应答在攻毒后可导致严重的肺部炎症。中和抗体活性偏低主要是由于FI-RSV表面缺失融合前F表位所致，而Th2偏向性免疫应答则是福尔马林灭活的病毒疫苗的特性之一。因此，安全有效、可用于婴幼儿的RSV候选疫苗应同时具有很好的中和活性以及诱导Th1偏向的免疫应答。
　　本研究的创新点和主要内容总结如下:
　　第一，CpG-C插入到质粒中能提高RSV DNA疫苗的免疫原性和保护性免疫应答，同时还具有Th1偏向的特点，可用于研发以婴幼儿为目标人群的RSV疫苗。
　　本项研究中，对嵌入型CpG-C提高RSV DNA疫苗免疫原性的能力进行了评价。分别将5拷贝和20拷贝的CpG-C基序插入到携带有RSV F基因的质粒中，免疫小鼠后，发现，插入CpG-C基序能够使DNA疫苗诱导产生更高的血清抗体及中和抗体，同时能够产生更强的Th1偏向的免疫应答。在保护免疫小鼠抵抗病毒感染、降低肺组织病理和病毒复制、以及减轻体重下降等方面，插入20拷贝CpG-C序列的RSV DNA疫苗更加有效。
　　第二，在F蛋白成熟的过程中，其F0前体被切割为两个亚单位和一个多肽片段后（F1、F2亚单位和27个氨基酸的多肽片段P27），P27被认为是非必要的短肽而被释放。为尝试获得融合前构象的F蛋白，将P27滞留在F2的C末端(命名为M1-F)，结果证明，这样的改造具有稳定Pre-F结构的作用，与野生型F蛋白(F)相比，表达量没有下降，但M1-F在293T细胞中表达的融合前表位却显著高于F。
　　本项研究中，通过突变位于F0前体的两个弗林酶切割位点，研究对F蛋白构象的影响。结果显示，无论是下游切割位点Ⅱ的单独突变(M2-F)还是联合上游切割位点Ⅰ的突变(U-F)均导致了相应突变的F蛋白M2-F和U-F表达量的急剧下降。而单一突变切割位点Ⅰ(M1-F)，对蛋白的表达量并没有影响。同时，与F相比，在质粒转染的细胞表面，M1-F有更多的融合前表位。
　　第三，为维持融合前M1-F蛋白结构的稳定性，设计、构建了一系列基于M1-F的突变体。经筛查，发现了能高效表达并且具有较高热稳定性的M1-F-1的突变体。同时以编码该突变体的质粒免疫小鼠，显示具有很好的免疫效力。
　　本研究中，通过引入二硫键以进一步增强M1-F蛋白的热稳定性。突变体M1-F-1及M1-F-5有较高的表达量，因此对他们的热稳定开展进一步的研究。质粒表达的两种突变体蛋白，经55℃孵育10分钟，显示融合前Φ表位的稳定性明显高于F和M1-F;M1-F-5在V表位也显示出比F、M1-F和M1-F-1更强的稳定性。在综合分析表达量与稳定性的情况下，37℃孵育2天后，M1-F-1的Φ表位含量明显强于其它任何组别。另外，在4℃或-20℃孵育0至4天，M1-F-1均显示出较多的Φ表位含量。同时，与编码F蛋白的质粒相比，编码M1-F-1突变体的质粒免疫BALB/c小鼠产生的血清抗体显著较低，但其中和抗体滴度明显增加，RSV攻毒后，M1-F-1组小鼠肺脏的病毒滴度与肺组织损伤明显降低。
　　综上所述，嵌入式CpG佐剂是增强RSV疫苗免疫原性及诱导产生Th1偏向的保护性免疫应答的有效方法，同时，突变F0前体上位于上游的弗林酶切割位点和引入二硫键可得到一种具有更多融合前表位和较高热稳定性的F蛋白，体内研究显示这种F蛋白突变体诱导保护性免疫应答的能力明显增强。这些工作为进一步获得具有自主知识产权的RSV疫苗奠定了重要基础。