背景细胞外基质(Extra-cellular matrix, ECM)是由细胞合成并分泌到胞外、分布于细胞表面或细胞之间的大分子,起到支撑、连接、保护作用,并通过多种信号传导系统全方位影响细胞形态、代谢、增殖、分化等。组成肿瘤ECM骨架最主要的物质是胶原蛋白,正常的ECM结构呈现动态平衡,组成成分受到严格控制,而肿瘤ECM则呈现失调的状态。近年来,肿瘤进展过程中胶原蛋白的成分和结构的变化成为研究的热点,多项研究发现,肿瘤侵袭过程中,ECM中的胶原蛋白可通过一系列酶的作用发生交联结构和形态的改变,最终促使肿瘤侵袭和转移,称为胶原纤维重构。在重构过程中,胶原纤维的质和量的变化,主要体现在胶原蛋白降解及再次沉积,再次沉积的胶原纤维交联增多、硬度增加。此外,重构的胶原纤维排列形态也发生了明显的变化,由包绕癌灶卷曲形态变为穿过癌灶的线性形态,肿瘤细胞可在此重构的线性胶原纤维上快速移动,导致侵袭性大大增强,有研究者将此穿过癌巢的胶原纤维称为肿瘤侵袭“高速公路”。Provenzano等将这种重构的胶原纤维定义为肿瘤相关胶原纤维形态(Tumor-associated collagen signature, TACS), TACS共分为3个阶段,TACS-3阶段的胶原纤维即为ECM重构后的胶原纤维形态,Conklin等也报道了TACS-3形态的出现可作为乳腺癌患者的独立不良预后指标。此外,肿瘤ECM内的胶原纤维还可分泌趋化因子募集炎症细胞浸润,通过分泌多种与肿瘤增殖相关细胞因子,例如白介素-1β (IL-1β)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)及E选择素,促进肿瘤血管生成、细胞粘附、诱导EMT现象等多个方面提升肿瘤侵袭性。综上所述,肿瘤ECM中的发生重构的胶原纤维从多个方面促进了肿瘤的侵袭、转移。Plod2是一种功能性的酶,位于细胞质的粗面内质网,参与胶原蛋白的翻译后修饰,主要功能是催化胶原蛋白端肽区赖氨酸残基羟基化。发生赖氨酸羟基化的胶原蛋白在分泌出细胞外后可相互交联形成稳定结构的羟赖氨酸吡啶链,相反,未发生羟基化的胶原蛋白所形成的纤维交联不稳定,容易降解。当细胞内Plod2表达明显升高时,由于羟赖氨酸吡啶链生成增加,将导致胶原纤维过度沉积,多项研究报道了纤维化疾病与Plod2过表达相关。前文已述,胶原纤维的重构在促进肿瘤侵袭性起了非常重要的作用,由此我们推测Plod2可能参与了肿瘤中的ECM重构过程,促进肿瘤ECM胶原纤维沉积,并通过形成癌巢内TACS-3形态胶原纤维提升了肿瘤细胞的侵袭性。目前,国内外大部分关于Plod2与恶性肿瘤方面的研究仅仅涉及到基因芯片检测水平,真正对Plod2与肿瘤机制方面的探讨极少。Gilkes等在Plod2与在乳腺癌的研究中,发现Plod2高表达与肿瘤患者高死亡率相关,对于癌组织的胶原纤维形成必不可少,为验证Plod2促进肿瘤侵袭的功能,分别将乳腺癌细胞和沉默Plod2表达的乳腺癌细胞注射入裸鼠体内成瘤,沉默Plod2表达的移植瘤组织硬度低,胶原纤维沉积量明显减少,且淋巴结转移灶及肺部转移灶的数量明显减少,提示了Plod2与肿瘤侵袭性的密切联系。Eisinger-Mathason等在未分化肉瘤的研究中进一步发现Plod2抑制剂米诺地尔能够减少癌巢内胶原纤维沉积,并减少了肿瘤肺内转移灶的数量。关于Plod2与宫颈癌的报道较少,Rajkumar等运用基因芯片技术分析了28例宫颈癌、4例CIN3/原位癌、4例CIN1/CIN2以及5例正常宫颈组织的基因表达差异,发现其中包括了Plod2在内的基因在宫颈癌中高表达。然而,Plod2蛋白在宫颈癌组织中是否高表达?能否作为宫颈癌患者有效预测指标?能否成为预防肿瘤转移的新的治疗靶位?这些疑问尚有待研究。HIF-1αa促进宫颈癌侵袭性增加已经得到共识,但其现象下的机制并不清楚。多项研究证实,HIF-1α可上调Plod2表达。因此我们猜想在宫颈癌的发生发展过程中,HIF-1α可能通过诱导了Plod2表达升高,继而改变胶原纤维交联模式并最终通过ECM重构促进宫颈癌侵袭性改变。我们所进行的研究,均围绕上述猜想而展开。研究方法1、检测PIod2在宫颈癌及癌旁组织的表达情况本研究需新鲜组织标本均来自南方医科大学南方医院妇产科,共11例宫颈癌、对应的癌旁组织手术标本。RT-PCR检测11例宫颈癌与癌旁组织Plod2表达差异。2、免疫组化检测宫颈癌癌组织及对应癌旁组织中Plod2、HIF-1α的表达收集南方医科大学南方医院2005年1月至2012年1月共164例宫颈癌标本及13例宫颈慢性不典型增生石蜡标本,其中164例标本中有75例对应的癌旁组织。通过免疫组化法检测组织中Plod2、HIF-1α蛋白表达,根据染色的范围及染色强度评分,分析Plod2、HIF-1α表达情况与宫颈癌患者临床病理学特征之间的联系,运用Spearman统计方法法分析HIF-1α与Plod2之间的关系。采用Kaplan-Meier法进行单因素分析,Hazard ration (HR)采用Cox模型计算得出。3、检测宫颈癌组织中胶原蛋白含量,分析Plod2表达与胶原蛋白沉积的关系1)从上述Plod2高表达的新鲜宫颈癌标本中选取6对癌与癌旁组织,Western blot检测宫颈癌与癌旁组织一型胶原蛋白(Co1-Ⅰ)的表达差异。2)将164例患者根据Plod2表达水平高低分为高表达组和低表达组,并将病理切片进行天狼星红染色,观察Plod2不同表达水平癌巢内胶原纤维形态,运用Image-Pro Plus6.0图像分析软件分析胶原纤维在沉积在整个视野内所占百分比。分别计算两组平均胶原纤维沉积百分比,通过独立样本t检验比较两组平均值。4、检测米诺地尔对Siha细胞Plod2表达的抑制作用Plod2在宫颈癌细胞株的表达情况。标本来源：宫颈癌细胞株HeLa、SiHa由南方医科大学南方医院肿瘤科实验室保存,用加入了10%胎牛血清的RPMI-1640培养。2例正常宫颈组织来自南方医院妇产科。Western blot检测Plod2在宫颈癌细胞株的表达,2例正常宫颈组织作为对照。2)培养宫颈癌Siha细胞株,用不同浓度米诺地尔作用Siha细胞后,光镜下观察细胞形态,Western blot检测Plod2的表达；同一浓度作用Siha细胞,不同时间点收集细胞,Western blot检测Plod2的表达；划痕实验检测经米诺地尔作用后细胞迁移能力的变化。研究结果1. Plod2在新鲜宫颈癌标本中的表达情况用RT-PCR检测方法检测11对宫颈癌及癌旁组织,发现9例癌组织的Plod2转录水平的表达高于对应的癌旁组织,比值均为2倍以上。2.免疫组化检测Plod2、HIF-1α在宫颈癌组织中的表达(1) Plod2在164例宫颈癌标本中阳性表达率为60.4%,其中75例同时具有癌与癌旁组织的标本中Plod2阳性表达率分别为42.7%,0%；13例宫颈上皮瘤样变仅一例弱阳性。(2)Plod2的高表达与宫颈癌的脉管癌栓(P=0.007)、深肌层浸润(P=0.001)、肿瘤大小(P=0.018)、盆腔淋巴结转移(P=0.025)密切相关,与其年龄、分期、病理分类、病理分级无关。(3)HIF-la的高表达与宫颈癌的肿瘤大小(P=0.024)、深肌层浸润(P=0.016)密切相关,与患者年龄、分期、病理分类、病理分级、淋巴结转移无关。(4) Spearman相关性分析提示,Plod2与HIF-la成正相关,相关系数r=0.400,P<0.001。(5)Cox生存分析提示Plod2为宫颈癌患者的独立预后因素(P=0.004)。3. Plod2表达与宫颈癌组织胶原蛋白含量之间的关系1) Western blot检测发现6对癌与癌旁组织中,一型胶原(COL-1)在癌组织的表达高于对应的癌旁组织。2)对164例宫颈癌切片进行天狼星红染色,发现Plod2高表达组的癌巢内的癌细胞沿胶原纤维走形分布,结构松散,胶原纤维形态致密,垂直穿过癌巢；Plod2低表达的癌巢内癌细胞排列紧密,胶原沉积较少,主要呈现包绕癌巢周围的形态。3)利用IPP图像分析软件得出Plod2高表达组平均胶原纤维沉积百分比为10.93±6.83(%),Plod2低表达组平均胶原纤维沉积百分比为5.59±4.89(%),两组胶原纤维沉积百分比的差异具有统计学意义(P<0.001)。4.米诺地尔对Siha细胞Plod2的抑制作用1)宫颈癌细胞株HeLa、SiHa中Plod2在蛋白水平表达明显高于正常宫颈上皮组织。2) Siha细胞株经米诺地尔浓度梯度以及时间梯度作用后,Plod2表达均有下降,细胞形态由梭型变为椭圆且伪足减少；此外,经米诺地尔作用,Siha细胞迁移能力明显下降。结论1) Plod2在宫颈癌细胞及组织中高表达,其高表达与宫颈癌的侵袭性升高密切相关,是宫颈癌患者独立不良预后因子；2)宫颈癌侵袭性的升高可能通过HIF-1α、Plod2途径,促进肿瘤ECM胶原纤维重构实现；3) Plod2有可能成为判断宫颈癌患者进展及预后分子标志物,为宫颈癌的预后判断及治疗提供了新的分子靶点。