新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽类急性、高度接触性传染病,其主要临床表现为浆膜黏膜出血、呼吸困难、下痢及神经紊乱等。该病传播速度快、致死率高、接触传染性强、分布广泛,对全球家禽业造成了重大影响。尽管弱毒疫苗和灭活疫苗接种家禽是预防和控制新城疫最有效的方法,但全球商业家禽群中新城疫的不断暴发表明,常规疫苗接种不足以控制这种疾病。因此,需要研发更加安全、可靠的新城疫新型疫苗。HN蛋白是新城疫病毒的主要结构蛋白,是新城疫病毒免疫应答的主要靶点,具有良好的免疫原性,可诱导机体产生免疫应答,一直是新城疫亚单位疫苗的研究热点。毕赤酵母表达系统具有生长速度快、翻译后修饰、分泌表达、易于遗传操作等显著优势,是理想的外源蛋白表达体系。本研究我们选择毕赤酵母表达系统对HN蛋白进行表达,并以SPF鸡为试验动物,检测了 HN蛋白的免疫原性。主要进行以下几方面工作:1.HN重组蛋白的表达和鉴定为获得具有免疫原性的HN蛋白,本研究将优化的HN基因胞外区序列克隆入毕赤酵母表达载体pPICZaA中,构建毕赤酵母表达载体pPICZaA-HN,并将其电转入毕赤酵母X-33感受态中,经PCR鉴定得到阳性克隆。对阳性菌液进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,结果表明HN重组蛋白在毕赤酵母中成功表达。通过对诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度和诱导培养基初始pH进行优化,探索最佳表达条件,Dot-blot检测结果表明,在28℃条件下,培养基初始pH为7.0,用0.5%甲醇诱导5天,HN蛋白的表达量最高。2.HN重组蛋白的纯化和活性鉴定通过镍柱亲和层析对HN重组蛋白进行纯化,经SDS-PAGE鉴定,镍柱一步纯化的HN重组蛋白纯度可达90%,经BCA试剂盒测定其表达量为25 mg/L。对纯化后HN重组蛋白进行活性鉴定,间接ELISA结果显示,HN重组蛋白能与NDV阳性血清特异性结合,表明其活性良好。利用去糖基化酶PNGase-F处理HN重组蛋白,结果显示HN重组蛋白存在糖基化修饰。3.HN重组蛋白的免疫效果评价将纯化的HN重组蛋白配合弗氏佐剂进行乳化后,免疫SPF鸡,免疫后每周采血检测血清中NDV抗体效价和血凝抑制抗体效价,且抗体效价分别最高达到212.4和26.2,表明HN重组蛋白可以刺激SPF鸡产生高水平的体液免疫应答。另外,检测了二免后21天鸡血清中IL-2和IFN-γ的含量,结果显示免疫后的SPF鸡产生了一定水平的细胞免疫应答。二免后第21天对免疫鸡进行攻毒,结果表明HN重组蛋白免疫组对SPF鸡的免疫保护率为70%,并能减少病毒对组织器官的损伤,具有成为ND亚单位疫苗的潜力。综上,本研究成功建立了NDVHN重组蛋白毕赤酵母高效表达体系,且获得了高纯度且活性较好的HN重组蛋白,免疫SPF鸡可对新城疫强毒攻击产生70%的保护。为后续新城疫亚单位疫苗的研发及新城疫检测试剂的研制奠定了一定基础。