[研究背景]p21蛋白是细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子(CDKI),可以与多种通路的不同信号分子相互作用,在整个细胞调控系统起到重要作用,同时p21作为一种重要的癌症相关基因,在肿瘤的发生发展中也有重要作用。活性氧(ROS)是细胞内化学性质活泼、氧化能力强的各种含氧离子或分子的总称,主要包括超氧阴离子自由基、单线激发态氧、羟自由基、过氧化氢和过氧化物等物质。近年来大量的研究数据都能表明,活性氧作为一种重要的信号分子,可以参与细胞中多种生命活动的调控,包括细胞分裂、分化、肿瘤等生理和病理变化。在正常生命活动的氧化代谢过程中产生的ROS,可以由组织内的防御机制来维持平衡。但在一些损伤因素的作用。下,细胞内的氧化代谢物增加,超过细胞自我修复能力,使活性氧堆积并对细胞产生毒害作用。目前对p21在ROS水平调控中的作用存在争议,p21对ROS的调节机制也有不同报道:有文献报道p21具有抗氧化作用,这种功能主要是由转录因子Nrf2介导的。Nrf2是抗氧化基因,其下游也有一系列的抗氧化基因。Keap1驱动Nrf2的泛素化降解,而p21可以和Keap1结合,与Nrf2形成竞争关系,使Nrf2更稳定,可以更好地发挥抗氧化的作用,在这种情况下敲除p21的细胞的ROS会比正常细胞要高,在受刺激的时候更为明显。而另有文献报道p21可以起到促氧化的效果,当敲除p21后,敲除细胞的ROS在压力刺激下明显减少,之后用了生物信息学的分析软件找到了 一个最为可能的p21调控ROS的通路:DNA损伤-p53-p21-GADD45A-MAPK14-GRB2-TGFβ-线粒体功能障碍-DNA 损伤,这证明存在于一个引发ROS升高的正反馈环上,敲除p21相当于阻碍了环的运行,可以降低ROS,p21起到促氧化作用的。我们推测,p21在ROS水平调控中的作用及其机制可能是细胞类型特异的。我们以多种细胞包括NHF(人成纤维细胞)、MSF(小鼠耳朵成纤维细胞)、MRC5(人成纤维细胞)、FTE187(人输卵管上皮永生化细胞)为研究对象,通过敲除或干扰p21后测定ROS水平,之后还检测了 NHF和MSF细胞的增殖与衰老情况。[研究目的]1.探讨p21对ROS的调控是否有细胞类型特异性;2.探讨p21介导的ROS调节对细胞命运的影响。[研究方法]3.通过RNA干扰敲低NHF等人类细胞p21的表达。4.通过小鼠耳朵成纤维细胞原代培养获得MSF细胞。5.利用流式细胞术检测敲除或干扰p21后各细胞的ROS水平在本底及IR处理后ROS的水平。6.利用Real-time PCR方法技术MSF细胞在p21缺失后,与p21作用的相关基因Nrf2及其靶基因NQO-1、HO-1等的表达。7.利用Western blotting检测敲除或干扰p21后各细胞中Nrf2与p-p38的变化。8.利用SA-β-gal染色技术检测NHF、MSF细胞在p21缺失或下调后的衰老情况。9.利用EdU插入法检测NHF、MSF细胞在p21缺失或下调后的增殖情况。[实验结果]1.MSF细胞在p21缺失后的ROS水平在本底及用IR处理后都有所降低,p38磷酸化下降,Nrf2及其靶基因基本不变,细胞衰老减少,增殖加快。2.NHF细胞在p21下调后短期内ROS水平在本底及IR处理后都有所升高,p38磷酸化升高,Nrf2下调。而细胞在长期低表达p21后,ROS水平在本底及IR处理后均出现降低,p38磷酸化降低,Nrf2上调,更长期的筛选后,p21低表达细胞Nrf2水平明显降低,细胞在p21下调后都出现衰老减少,增殖加快的现象。3.在MRC5和FTE187在p21下调后的ROS水平分别各有上调和下降,其中MRC5细胞中Nrf2与p38磷酸化的变化与MSF细胞相似,而在FTE187细胞中Nrf2与p38磷酸化的变化与我们实验所用另几种细胞都不一致。[结论]1.p21短期下调对细胞ROS的影响具有细胞特异性(在MSF、MRC5中p21缺失或下调ROS下降,在NHF、FTE187中p21下调ROS上升)。2.p21长期缺失或下调导致细胞ROS下降(NHF、MRC5、MSF)。3.p21缺失或下调引起的ROS上升经由Nrf2途径介导(NHF),p21缺失或下调引起的ROS下调经由p38途径介导(MSF)。4.p21缺失或下调导致的细胞衰老减少,增殖加快不依赖ROS(MSF、NHF)。