新疆维吾尔自治区位于我国西北边陲,亚欧大陆腹地,与俄罗斯、蒙古、巴基斯坦等8家接壤,陆上对外口岸较多,与周边国家经济交往频繁。新疆地理生态环境多样,物种分布广与内地有着明显的不同,适合蜱的生长繁殖,其分布广泛,种类较多,可传播多种虫媒病毒。新疆地区时有人、畜不明原因发热和脑炎散发或流行,疑似虫媒病毒引起,但是由于种种原因,目前还没有进行过系统而深入的调查,急需加强研究。我国已知流行的4种虫媒病毒病中新疆出血热和蜱传脑炎在新疆都有发现,在新疆既往进行的虫媒病毒调查中,已经从新疆地区的全沟硬蜱、森林革蜱、亚洲璃眼蜱、边缘革蜱和草原革蜱中分别分离到蜱传脑炎病毒,东方马脑炎病毒,新疆出血热病毒、新环状病毒。从按蚊、库蚊、伊蚊中分别分离到辛德毕斯病毒,西方马脑炎病毒,辽宁病毒,Tahyna病毒等。但尚缺乏对新疆准噶尔盆地周边地区虫媒病毒的深入调查研究。为了解新疆准噶尔盆地周边地区蜱及啮齿动物(鼠)携带虫媒病毒情况,应用RT-PCR、细胞培养及生物信息学等方法对该地区蜱及啮齿动物(鼠)感染虫媒病毒情况进行了调查研究。本项研究结果对丰富新疆乃至国内虫媒病毒资源和进行新疆地区虫媒病毒病预防控制具有重要意义。主要内容包括以下方面:1.新疆啮齿动物(鼠)样本采集及携带虫媒病毒的初步检测2014-2015年在新疆准噶尔盆地周边地区乌苏、阜康、奇台、吉木萨尔和石河子149团等地区采集了1054只啮齿动物,其中2014年,2015年分别为684只和370只,主要种类有长尾黄鼠(Spermophilus undulatus)、子午沙鼠(Meriones meridianus Pallas)、大沙鼠(Rhombomys opimus)和三趾跳鼠(Dipus sagitta)。2014年鼠样本根据采集地、属种与脏器的不同分成193组。通过RT-PCR的方法对鼠中发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)、新疆出血热病毒(XHFV)、荆门病毒(JMTV)以及古尔图病毒(Guertu virus)的感染情况进行了检测。结果发现总样本中Guertu virus的S片段阳性率为9.3%,SFTSV的S片段阳性率为6.2%。Guertu virus与SFTSV主要集中在乌苏地区,主要宿主为长尾黄鼠。提示长尾黄鼠为Guertu virus与SFTSV新的宿主。2015年样本同样方法分组成136组,除检测以上4种病毒外还检测了汉坦病毒(HTV),蜱传脑炎病毒(TBEV)与黄病毒属病毒(Flavivirus)。结果显示总样本中XHFV的阳性率为11%,SFTSV阳性率为7.4%,Guertu virus阳性率为21.3%。阳性样本主要集中在乌苏地区。根据2014-2015年对准噶尔盆地周边地区鼠样本的检测结果,提示新疆乌苏地区可能存在XHFV、SFTSV与Guertu virus的自然疫源地。2.新疆蜱中新病毒的发现、分离及在蜱中分子流行病学调查2014年在新疆乌苏地区共采集了13662只草原革蜱(Dermacentor nuttalli)。根据采集地与蜱种类不同按每组约200只左右分成68组,选取8组有代表样性的样本,经武汉中科院病毒研究所的454高通量测序,有7组样本中存在黄病毒科病毒的重叠群(Contig)。对获得的Contig利用NCBI中的BLISA工具搜索,发现所有Contig都与荆门蜱病毒(Jingmen tick virus,JMTV)的核酸序列相似性最高,在65%-84%之间。暂将该新病毒命名为新疆蜱病毒(Xinjiang tick virus,XJTV)。选取454高通量测序的3组阳性样本,利用Vero细胞对XJTV进行病毒培养和分离,细胞传至第7代后,仅在第一代培养细胞的上清中检测到有XJTV的核酸片段,同时对第一代细胞的上清及细胞制备切片进行电镜观察,发现在细胞与上清中存在90nm左右的病毒粒子。通过RT-PCR对XJTV在乌苏地区蜱中的流行情况进行检测。结果表明,2014年乌苏地区的68组草原革蜱中,检测到XJTV阳性组数54组,其阳性率达79.4%。说明草原革蜱为XJTV的媒介之一,该病毒可能在乌苏地区的蜱中广泛分布。3.新疆蜱携带XJTV基因组序列信息分析与克隆454高通量测序的Contig与JMTV基因序列比对后发现只有部分S1与S3的信息,利用获得的基因序列设计引物进行RT-PCR得到了该病毒的S1与S3全序列信息。对采自新疆羊沟地区的一份阳性样本经RNA-Seq技术(上海伯豪公司)分析获得了S2与S4的部分序列信息,通过设计特异性引物用RT-PCR的方法获得了该病毒的S2与S4全序列信息。利用RT-PCR和重叠RT-PCR的方法分别将结构蛋白S1,S2,S3与S4全基因序列克隆到p GEM-Teasy载体中,这为更好地保存病毒的基因组信息,以及对该病毒分子特性和相关基因功能等性质的研究提供了基础。4.XJTV非结构蛋白和结构蛋白的生物信息学分析利用相关生物学软件Signa IP 4.1、TMHMM、Net NGlyc1.0 Serve、Phrye、MEGA5与DNAStar等对XJTV编码的非结构蛋白(NSP1与NSP2)和结构蛋白(VP1、VP2和VP3)进行了分析。在二级结构中XJTV与黄病毒科的代表株在非结构蛋白的功能区域的motif保守性较高。利用已经解析蛋白晶体结构的登革热病毒(DENV-4)和日本脑炎病毒(JEV)作为模板模拟出XJTV的S1与S3编码蛋白的三维结构。结果发现XJTV基于二级结构保守的motif在空间位置上也与模板蛋白的motif一一对应,提示这些保守结构在病毒的生命周期中可能行使着相同的生物学功能。对结构蛋白VP1、VP2与VP3的跨膜区域、信号肽与糖基化位点进行分析预测,结果表明结构蛋白VP1、VP2与VP3分别具有病毒的包膜蛋白、衣壳蛋白和膜蛋白的功能。基于XJTV的S1与S3编码的非结构蛋白构建的系统发育进化树分析结果显示,与选择的黄病毒科的部分代表毒株相比,XJTV不属于黄病毒科已有的三个属,而与JMTV和MGTV位于进化树单独的分支中。提示XJTV可能是黄病毒科一个新的属中的毒株。5.XJTV衣壳蛋白重组表达质粒的构建及其兔多克隆抗体的制备将XJTV与JMTV编码结构蛋白的基因序列进行比较后,选取相对保守的衣壳蛋白(Capsid protein)ORF片段序列,将其构建到原核表达载体p ET28a与p ET32a中,同时构建至真核表达载体pc DNA3.1中,通过序列测定,结果表明成功获得了三种表达质粒p ET28a-CP,p ET32a-CP和pc DNA3.1-CP。将p ET28a-CP质粒转染大肠杆菌中表达纯化获得重组蛋白,用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备抗体,经检测所获得的抗体效价达1:100000以上,通过western blot检测证实了该抗体与抗原有很好的结合亲和性。构建的原核表达质粒及制备的抗体可为后续开展病毒血清学检测及XJTV的免疫学特性研究工作提供了条件。将构建的真核表达载体p CDNA3.1-CP转染入293T细胞,经IFA检测,表明VP2基因编码的衣壳蛋白在该细胞中成功表达,这为后续病毒的包装以及对哺乳动物的侵染机制研究提供了基础。