草绿色链球菌(Viridans Streptococci, VS)作为口腔、上呼吸道、胃肠道的常驻菌群,早期被认为是人体正常菌群的组成部分。但近年来VS引起的口腔颌面软组织、生殖道感染、心内膜炎等的病例不断增多。最常见VS全身性感染——感染性心内膜炎,可以由牙科治疗,甚至刷牙导致的VS一过性菌血症产生,并引发体内免疫反应；VS也是癌症、骨髓移植、免疫缺陷肺炎等患者重要的感染源,当感染造成败血症时常常引发感染性休克导致死亡；牙源性间隙感染为常见颌面部严重感染之一,可继发海绵窦血栓性静脉炎、脑脓肿、败血症、纵膈炎等严重并发症,危及患者生命,而VS现在被视为牙源性间隙感染常见病原菌之一,参与了深部脓肿的形成。近年来牙周炎与冠心病的相关性研究显示：VS可促进血小板聚集,加快血凝,形成血栓,从而可能引发低血性心血管疾病的发生。其机制可能是VS分泌血小板聚集相关抗原(platelet aggregation-asso-ciated protein, PAAP),与血小板聚集有关；PAAP是一种毒力因子,还可充当热休克蛋白促发自身免疫反应而引发早期动脉粥样硬化损伤。VS及其代谢产物还可诱导脉管细胞异常增殖,影响和改变脉管细胞生理功能,直至细胞死亡进而促发局部急性缺血。而且VS通常处于斑块不稳定部位,可能影响粥样斑块的进展,预示斑块的破裂,触发急性冠脉综合征或缺血性中风。近年来监测报告显示：VS对常用抗生素药物敏感性均有明显降低,其中青霉素耐药率达到22.4%,头孢唑啉耐药率为17.9%,呋喃妥因、利福平耐药率近50%,环丙沙星、四环素、克林霉素、复方磺胺甲噁唑、红霉素耐药率60%-80%以上。2009-2012年国内权威监测报告显示：VS对β-内酰胺类抗生素的耐药率超过了高致病性β-溶血性链球菌。耐药VS的快速出现,导致临床筛选敏感抗生素压力增大,感染治疗困难,病程迁延。自然界中90%以上的细菌以生物膜(bacterial biofilm, BF)的形式生活,超过65%的人类细菌感染与生物膜有关。生物膜能通过多种机制对膜内细菌起屏障保护作用,避免或减少药物和机体免疫系统对细菌进行处理,显著增加生物膜细菌的致病力与耐药性。研究亚急性心内膜炎发现：VS能够在受损心内膜表面形成类似生物膜的细菌赘生物；邹彬彬等在尿路感染患者导尿管内获得了VS生物膜,该生物膜的耐药性超过浮游菌。上述研究提示VS具有形成生物膜的能力,生物膜是VS耐药的重要影响因素。目前认为生物膜细菌耐药机制包括：(1)生物膜屏障机制,即胞外多糖基质阻止抗生素药物接触生物膜细菌;(2)营养限制,即生物膜细菌生长速度减慢,膜内营养物质、氧气的消耗以及代谢废物的聚集促使细菌进入一种非生长状态,该状态下细菌对抑制其生长的抗生素药物几乎完全不敏感；(3)β-内酰胺酶,细菌产生的β-内酰胺酶在生物膜表面基质内高浓度聚集,迅速水解渗透进入的β-内酰胺类抗生素,有效保护深部细菌不被β-内酰胺类抗生素药物灭活；(4)密度感应,细菌通过监测群体细胞密度来调节特定的基因表达,以保证生物膜中营养物质的运输和废物的排出,避免细菌过度生长而造成空间和营养物质缺乏。密度感应(Quorum Sensing, QS)是一种根据密度对细菌基因表达进行调控的机制。自体诱导物(Autoinducer, AI)信号分子由细菌在胞内合成,分泌至胞外环境：自体诱导物的浓度随着生物膜中细菌数量的增加而不断升高。细菌通过对外环境中自体诱导物浓度的感应而进行周围细菌“计数”；当自体诱导物浓度达到阈值,AI与细菌表面信号受体蛋白结合,直接或间接调控细菌目的基因表达。细菌密度感应调控普遍存在于G+、G-细菌中,生物膜结构的稳定、细菌毒力因子表达、耐酸性和耐药性都受AI信号分子的调控。在感染建立过程中发挥重要作用,因此干扰密度感应调控降低生物膜细菌致病力与耐药性,从而用较低的抗生素浓度治疗或通过宿主防御系统自然消除感染已经成为目前研究的一个主要热点。常见QS调控机制可分为三种类型：①G+细菌QS调控以寡肽类物质作为信号分子,寡肽信号分子是前导肽在细菌细胞内经过修饰处理而成,细菌种属不同形成的寡肽类物质不同,ATP结合区(ATP-binding cassette, ABC)转运系统负责细菌体内寡肽信号分子的输出,双组份识别系统负责感应寡肽信号分子；②G-细菌中存在Luxl/LuxR QS调控机制,酰基高丝氨酸环内酯类物质(acyl-homoserine lactone, AHL)作为信号分子,即AI-1; LuxⅠ类蛋白酶是AI-1合成所必需的,LuxR类结合蛋白则进行AI-1的识别和基因调控；③G+、G-细菌中共同存在的信号分子,呋喃酰硼酸二酯(furanosyl borate diester),即AI-2信号分子,其合成主要依赖LuxS基因编码的LuxS蛋白酶。寡肽信号分子和AHL信号分子主要介导细菌种内信号识别,AI-2则是细菌种间交流的通用信号分子。AI-2信号所控制的细胞间信息交流已被证实在细菌生长过程中发挥重要作用,影响生物膜的形成、发展及其功能发挥。对牙周病致病菌培养液的检测显示AI-2信号分子的存在,任一细菌AI-2信号分子的产生都有助于种间交流和混合种生物膜的形成。LuxS基因广泛存在于不同细菌,高度保守。LuxS基因编码的蛋白酶是AI-2合成的必需催化物,LuxS基因被认为是合成AI-2信号分子的标志性基因。AI-2信号分子,呋喃酮酰硼酸二酯(furanosyl borate diester),其双五圆环结构具有对称性,腺苷甲硫氨酸(SAM)是其合成的起始底物,中间产物为S-核糖基同型半胱氨酸(SRH),AI-2信号分子前体物,4,5-二羟基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2, 3-pentanedione, DPD)则由LuxS蛋白酶催化SRH形成,最后在硼离子作用下发生重排,形成AI-2。A1-2信号分子与细菌胞膜上的跨膜蛋白受体胞外区结合,自激酶活性磷酸化跨膜蛋白受体胞浆区,激活胞内同源调控因子,调控特定基因的表达。研究变异链球菌生物膜证实：可以通过LuxS基因突变干扰AI-2密度感应信号,影响生物膜的形成和耐酸性。另有研究指出AI-2密度感应信号对革兰阴性沙雷氏菌、铜绿假单胞菌成熟生物膜的抗生素敏感性具有重要影响。本研究通过敲除VS多药耐药野生株LuxS基因,阻断LuxS/AⅠ-2密度感应信号分子合成,干扰VS生物膜细菌密度感应调控,影响VS生物膜形成和耐药性：探讨LuxS/AⅠ-2密度感应信号在VS多药耐药野生株生物膜形成,p-内酰胺类、喹诺酮类及四环素类抗生素药物耐药中的作用与机制；从分子水平理解VS生物膜形成和耐药的产生,为降低细菌致病力,治疗生物膜感染,提供新思路、新途径和新靶标。第1章VS多药耐药野生株的分离与鉴定目的 获得研究所需目标菌株——草绿色链球菌多药耐药临床分离野生株。方法临床标本通过血平板培养、革兰染色、药敏试验筛选出疑似目标菌株；纯培养后行生理、生化试验,提取细菌基因DNA,多聚酶链式反应(PCR)扩增16SrDNA,测序后上传至NCBI数据库与已知序列比较,行16S rDNA序列同源性分析。结果临床分离多药耐药野生株(327045号),革兰染色阳性链球菌：a溶血；生化实验提示D群链球菌,缓症链球菌可能性大；16S rDNA序列同源性分析显示与缓症链球菌(S.mitis)同源性最高,99.58%。结论临床分离野生株(327045号)属于草绿色链球菌多药耐药野生株。成功获得本研究所需目标菌株。第2章 VS多药耐药野生株的致病力检测目的 了解目标菌株——草绿色链球菌多药耐药临床分离野生株的致病力,为下一步比较实验获取基线数据。方法 通过野生株上清液诱导V. harveyibb170报告菌株生物发光实验检测VS多药耐药野生株AI-2信号分子的存在与活性：酶标仪测量VS多药耐药野生株形成生物膜的吸光光度值,了解其生物膜形成能力；定量分析不同时间、不同类型、不同浓度抗生素对VS野生株生物膜形成量的影响,了解其耐药性,数据输入SPSS 17.0统计学软件,进行析因资料方差分析和单因素方差分析；Fluorecein Stain、18909 Calcofluor White Stain、 DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain荧光染色后,激光共聚焦显微镜扫描观测VS多药耐药野生株生物膜结构、胞外多糖分布、死活菌分布,全面了解VS多药耐药野生株的致病力表型。结果析因资料方差分析显示抗生素种类与浓度(P=0.034)、抗生素种类与干预时间(P<0.001)、抗生素浓度与干预时间(P=0.010)皆存在交互作用；主效应分析显示抗生素类型(P<0.001)、抗生素浓度(P=<0.001)、干预时间(P<<0.001)均可影响VS多药耐药野生株的BF形成。经单因素方差分析Dunnett t-tests多重比较显示初始期,环丙沙星耐药浓度(P=0.001)、中敏浓度(P<0.001)、敏感浓度(P<<0.001),四环素耐药浓度(P=0.012)、中敏浓度(P=0.009)、敏感浓度(P--0.001)实验组中抗生素均有效减少了VS多药耐药野生株BF的形成;中间指数期,实验组BF形成量与菌液对照组均不存在显著性差异(P>0.05)。生物膜结构复杂,且不均一；胞外多糖、死活菌分布特点多样,可受抗生素干预因素影响。结论 VS多药耐药野生株具有极强的生物膜形成能力和多重耐药性,致病力高,值得临床关注；抗生素治疗应遵循实验室检查结果。第3章VS LuxS基因突变株的构建目的通过同源重组法敲除VS多药耐药野生株的LuxS基因,构建VS LuxS基因突变株,为进一步研究LuxS基因在VS生物膜形成与耐药性变化中的作用做准备。方法运用同源重组法设计合成引物,分别以质粒PMG36E、VS多药耐药野生株(327045)DNA为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增得到红霉素抗性(Erm.)基因DNA片断和LuxS基因上下游序列,经双酶切反应插入pUC19质粒的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌感受态细胞,氨苄青霉和红霉素培养基筛选,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的VS多药耐药野生株(327045)中,利用红霉素抗性培养基筛选出LuxS基因缺陷突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)检测。结果PCR凝胶电泳结果显示：红霉素抗性基因和LuxS基因两侧同源序列成功连入到Puc19质粒相应酶切位点,VS LuxS基因突变株LuxS基因完全被红霉素抗性(Erm.)基因所取代。结论成功构建VS LuxS突变株。第4章LuxS基因缺失对VS野生株致病力的影响目的 了解LuxS/AⅠ-2密度感应信号缺失对VS多药耐药野生株生物膜致病力的影响,尝试探讨可能存在的机制。方法；V.harveyi BB170报告菌株生物发光实验检测AI-2信号分子的存在与活性；吸光光度值定量分析VS多药耐药野生株与LuxS基因突变株生物膜形成量与耐药性差异；Fluorecein Stain、18909 Calcofluor White Stain、DEAD/LIVE Backlight Bacteria Viability stain荧光染色后,激光共聚焦显微镜扫描VS多药耐药野生株与LuxS基因突变株BF,比较二者在生物膜结构、胞外多糖分布、死活菌分布方面的差异；通过野生株上清液、DPD补偿生长实验确认VS突变株表型发生的原因。数据输入SPSS 17.0统计学软件,进行Kolmogorov-Smirno test非参数检验。结果Kolmogorov-Smirno test显示：VS LuxS基因突变株与野生株菌液BF形成量存在显著性差异(P<0.001)；同样条件下,氨苄西林(P<0.001)、环丙沙星(P<0.05)、四环素(P<0.001)干预VS LuxS基因突变株与野生株BF形成量均存在显著性差异。突变株菌液BF形成量与VS野生株上清液、DPD补偿实验组BF形成量,均存在显著性差异(P<0.001)；野生株菌液BF形成量与VS野生株上清液(P=0.320)、DPD(P=0.683)补偿生长实验组BF形成量均不存在统计学差异。VS LuxS基因突变株生物膜形成量减少,结构疏松改变,对氨苄西林、环丙沙星、四环素的耐药性下降,致病力降低。结论 该表型是LuxS基因缺失,AI-2信号分子合成障碍,由LuxS/AⅠ-2密度感应信号介导的细菌种间通信中断的结果。LuxS/AⅠ-2密度感应信号能够影响VS多药耐药野生株生物膜致病力,可以作为抗菌治疗新的途径和靶标。