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目的:利用连锁分析法对5个具有常染色体隐性遗传特点的国人视网膜色素变性(autosomal recessive retinitis pigmentosa,arRP)家系的致病基因进行染色体定位,明确该家系致病基因是否位于已知的arRP染色体位点内,在所定位的染色体区域内筛选可能的致病基因并明确其突变形式,并在一定程度上为患者及其家人提供遗传咨询；对3个Usher综合征Ⅱ型(USH2)家系进行USH2A基因直接测序分析,寻找其致病突变。
材料与方法:收集5个arRP家系(F1、F2、F3、F4、F5)和3个USH2家系(F6、F7、F8)；在征得知情同意后对参加本研究的所有家系成员进行详细的眼科检查并采集静脉血样；标准饱和酚/氯仿法提取基因组DNA；对于arRP家系,在位于第1、2、3、4、5、6、8、10、14、15、16、17、20号染色体上的24个已知arRP染色体位点(ABCA4,RPE65、USH2A、CRB1、CERKL、MERTK,SAG、RHO,PROM1、CNGA1、LRAT、PDE6B、PDE6A、TULP1,RP1、RBP3、RGR、NRL、SPATA7、NR2E3、RLBP1、CNGB1、PECD、IDH3B)内分别选取2～4个荧光标记微卫星进行基因型分析,即通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对荧光标记微卫星进行扩增,将扩增产物进行毛细管电泳可得到其基因型,如果微卫星基因型与表型共分离,则提示连锁；对于上述方法不能排除的位点,则选取这些位点10里摩以内的普通微卫星进行PCR扩增,其产物在8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和0.1％硝酸银染色后,进行微卫星基因分型；对提示连锁基因外显子的编码序列及内含子外显子交界区进行PCR扩增后进行直接测序分析；部分单核苷酸多态性位点进行单链构象多态性或限制性片段长度多态性或高分辨率熔解曲线分析。对于USH2家系直接进行USH2A基因测序分析。
结果:5个常染色体隐性视网膜色素变性家系参加了本研究；系谱分析表明致病基因在该家系中以常染色体隐性方式遗传；共选取位于24个知arRP染色体位点的荧光标记微卫星序列50个和普通微卫星标记14个进行基因分型和连锁分析；连锁分析结果表明F1家系的致病基因可能为MERTK基因；F2家系的致病基因可能为RP1或NR2E3基因；F3家系的致病基因可能为ABCA4基因；F4家系的致病基因不能排除为 PROM1基因；F5家系的致病基因可能为USH2A基因。分别针对F1、F2、F5家系的先证者进行MERTK,RP1或NR2E3、USH2A基因外显子及外显子内含子交界区直接测序,MERTK、RP1基因未发现异常序列改变,NR2E3基因发现1个已经报道过的致病突变,USH2A基因发现2个错义的致病突变。收集到3个Usher综合征Ⅱ型家系,对其先证者进行USH2A基因直接测序,找到3个家系的致病突变共6个,分别为无义突变或框移突变。因此,本研究共发现8个致病突变,其中7个为新突变。
结论:在1个国人常染色体隐性视网膜色素变性家系(F5)和3个Usher综合征Ⅱ型家系(F6、F7、F8)中发现了7个尚未报道过的USH2A致病突变和9个非致病碱基序列改变(其中1个为本研究新发现)。初步分析,这1个国人常染色体隐性视网膜色素变性家系和3个Usher综合征Ⅱ型家系的USH2A基因和其表型存在对应关系。F1、F2家系致病基因分别定位于MERTK基因、RP1或NR2E3基因,直接测序分析却未发现明显基因突变,两个家系致病基因突变是否为基因非编码区突变、基因复杂突变(如大片段缺失)或是否存在新的视网膜色素变性致病基因尚有待于进一步研究。F3、F4家系还需继续进行DNA序列分析和连锁分析,以明确其致病基因及突变类型。