论文部分内容阅读
南极气候酷寒,环境干燥,一些区域终年覆盖冰雪。南极海冰中存在着大量的微生物及其产生的胞外多糖,这些胞外多糖起着传输能量和保护细胞的作用。极端特殊的环境造就了不同于陆生环境的南极微生物。南极微生物是开发具有特殊应用价值的活性物质的资源库。一直以来,研究较多的是南极微生物胞外多糖在生态系统中的意义,而这类多糖的免疫活性则研究的较少,尤其是关于南极微生物胞外多糖对巨噬细胞的免疫调节功能还未见报道。本文以中国第十九次南极科学考察采集得到的海冰海水中的43株南极细菌为材料,通过刚果红法和台盼蓝法染色筛选出15株产糖菌；其中一株高产糖南极海洋菌S-5经16S rDNA鉴定为假交替单胞菌属。确定该菌的培养条件后从该菌的发酵液中分离纯化得到纯度较高的多糖样品PEP。采用红外光谱(IR)、气相色谱(GC)、甲基化分析、1维核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)和2维核磁共振谱(COSY谱、NOESY谱、HSQC谱)分析确定多糖PEP的结构,并研究该胞外多糖对巨噬细胞的免疫调节功能以及对正常昆明小鼠的免疫系统的影响,期望为南极资源的开发利用提供科学依据。1.通过对43株南极海洋菌的显微观察结合刚果红法和台盼蓝法筛选出产胞外多糖的菌株15株。16S rDNA鉴定结果表明,南极海洋菌S-5是一株假交替单胞菌Pseudoaltermonas sp.S-5。由于假交替单胞菌是南极生态系统中最常见也是很重要的一类细菌,且S-5的产糖量相对而言比较高,所以对其进行了进一步的研究。南极海洋菌Pseudoaltermonas sp.S-5细胞呈椭圆状,革兰氏染色阴性。2.对南极海洋菌S-5的实验室培养条件的研究结果表明,南极海洋菌S-5在4-25℃下均能正常生长,因此确定其为适冷菌,即南极适冷菌Pseudoaltermonassp.S-5,该菌产胞外多糖的最佳产糖条件为：最适温度,9℃；最佳碳源,1%的葡萄糖；最佳pH值7.0左右。3.南极适冷菌Pseudoaltermonas sp.S-5发酵液经去菌体后浓缩,经乙醇沉淀、除蛋白后得到粗多糖CEP。粗多糖首先经DEAE-Fast Flow阴离子交换层析获得两个组分,将其中用蒸馏水洗脱下来的中性多糖命名为N-CEP, NaCl洗脱下来的酸性多糖为A-CEP, N-CEP进一步经过Sephadex G-75凝胶层析纯化,获得对称的单一峰,该组分为PEP。冷冻干燥后经碘-碘化钾反应、双缩脲反应、α-萘酚显色反应以及HPLC检测,无蛋白、核酸及其它杂质存在；表明样品纯度较高。以高效凝胶渗透色谱(HPGPC)测定PEP的分子量为397kDa。4.南极适冷菌Pseudoaltermonas sp. S-5胞外多糖PEP经GC分析确定其由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,但由于PEP的分子量过大,难以进行甲基化分析和核磁共振图谱采集,因此对PEP进行酸水解。经探索最终确定了适宜的水解条件为0.01M三氟乙酸水解1h,水解产物经Bio-gel P2聚丙烯酰胺凝胶层析柱分离得到均一组分H-PEP,分子量经测定为4023Da。经红外光谱、甲基化分析、1D和2D核磁共振图谱分析,确定H-PEP的单糖构型及其连接方式如下：5.体外细胞实验结果表明,南极适冷菌Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖PEP能在体外促进脾淋巴细胞的增殖,并且与ConA有协同作用。PEP能激活巨噬细胞,改变巨噬细胞的形态,50μg/ml PEP刺激使活化的巨噬细胞增加至细胞总数的45%,比对照高出137%；PEP还能提高巨噬细胞的噬菌能力,最高能使吞噬指数提高133%；PEP还能激活巨噬细胞酸性磷酸酶,并产生NO,分泌TNF-α、IL-1β。通过半定量RT-PCR实验,可以确定PEP处理巨噬细胞能提高TNF-α、IL-1β和iNOS基因的转录水平,这与细胞实验结果相符。6.以5、10和25mg/kg/day三个剂量的南极适冷菌Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖PEP对正常小鼠灌胃给药,连续10天后小鼠的脾指数上升,迟发型变态反应增强,此外,处理组小鼠腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶活性大大提高,吞噬能力增强,NO产量也有所提升,血清中TNF-α和1L-1β两种,细胞因子的含量比对照组高。另一方面,PEP对正常小鼠的B细胞和血清介导的溶血反应及脾淋巴细胞的增殖无明显的影响,这些结果说明PEP在本实验条件下可通过激活巨噬细胞增强机体的非特异性免疫,但是对体液免疫过程和T细胞的增殖作用无显著作用。综上所述,南极适冷菌Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖PEP是由葡萄糖和半乳糖组成主链,并在葡萄糖6位上有分支连接甘露糖和半乳糖的复杂多糖；该糖在体外能刺激巨噬细胞的免疫活性,并且能通过激活巨噬细胞增强正常小鼠的的非特异性免疫作用和免疫调节作用,但是对体液免疫过程和T细胞的增殖作用无显著作用。本文首次测定南极细菌胞外多糖对巨噬细胞的免疫调节功能,验证了南极微生物胞外多糖作为免疫调节剂的潜力,为具有特殊价值的南极微生物代谢产物的开发应用提供了理论基础。