肺癌的治疗早已进入靶向治疗时代,然而,尽管表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂、间变性淋巴瘤激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂等大批明星靶向药物已成功应用于临床,肺癌五年总体生存率之和仍然低至15.9%。这说明我们对于肺癌的发病机制还缺乏足够的认知,并且缺乏针对早期肺癌的诊断性标志物和治疗靶点。众所周知,基因通常不是单独起作用的,他们的背后往往存在非常复杂的调控网络,近年来越来越多的研究表明非编码RNA在基因表达的启动等过程中发挥重要调控作用。非编码RNA主要分为两个亚型:转录本少于200nt的非编码性小RNA(microRNA)及转录本介于200 nt至100 kb间的长链非编码RNA(1ong non-coding RNA,lncRNA)。既往人们对于非编码RNA的研究主要集中在microRNA,而lncRNA往往被认为是“垃圾RNA”,但近几年来的研究表明它们的异常表达在许多疾病和肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。LncRNA可能通过直接与RNA、DNA或蛋白质结合,在表观遗传、转录及转录后水平通过复杂的调控机制影响细胞增殖、分化、凋亡、迁移及免疫等多种生物学功能,具有较高的组织特异性、敏感性和可靠的稳定性,可作为肿瘤治疗的信息标志物和治疗靶点。这些研究结果使lncRNA成为新的研究热点,并显示出良好的临床应用前景。目的:利用GEO数据库基因芯片及TCGA数据库进行差异性表达靶基因筛选,结果表明CCNE1在肺腺癌中高表达,与不良预后密切相关。进一步预测发现CCNE1可能作为miR-195的靶基因,而长链非编码RNA LINC00355能够与miR-195结合,且与miR-195/CCNE1存在相同的结合位点。同时,利用TCGA数据库分析三者表达水平,结果表明LINC00355及CCNE1在肺腺癌中高表达,miR-195低表达,相关性分析提示miR-195表达水平与LINC00355及CCNE1呈负相关。基于以上数据,我们猜想LINC00355可能通过下调miR-195进而上调CCNE1的表达促进肺腺癌细胞的增殖。目前尚无关于LINC00355具体生物学功能的研究报道,部分关于LINC00355的相关数据库分析提示其在结肠腺癌及膀胱癌中高表达。因此,本研究通过检测LINC00355在肺腺癌组织及细胞中的表达及与临床病理因素、预后之间的关系,并通过体内外实验观察LINC00355的生物学功能。通过分别构建和转染识别miR-195互补序列的突变型/野生型LINC00355及CCNE1质粒,进行靶向关系及调控作用的验证,阐明LINC00355在肺腺癌中发挥作用的可能机制。研究方法:1.通过pubmed GEO数据库下载肺腺癌基因芯片,筛选在肺腺癌及癌旁组织中差异表达比较显著的mRNA-CCNE1,利用TCGA数据库验证CCNE1的表达及与预后的关系。2.生物信息学预测CCNE1可能是miR-195的靶基因,而miR-195可能是长链非编码RNA LINC00355的靶基因。3.利用TCGA数据库分析肺腺癌中LINC00355及miR-195的表达,并进行相关性分析。4.在103例肺腺癌组织和癌旁组织中利用Real-time PCR检测LINC00355的表达,并统计分析患者临床病理学特征与肺癌组织中LINC00355表达水平的关系。5.EDU实验、细胞克隆形成实验、细胞周期实验检测干扰LINC00355前后肺腺癌细胞增殖活性的变化情况。6.流式细胞仪检测干扰LINC00355前后肺腺癌细胞早期凋亡的变化情况。7.Western Blot实验检测干扰LINC00355前后肺腺癌细胞中增殖、周期及凋亡相关蛋白表达的变化情况。8.LncAtlas网站预测并通过FISH实验检测LINC00355在肺腺癌细胞中的亚定位。9.生物信息学预测miR-195与CCNE1和LINC00355的结合位点,分别构建含有miR-195结合位点的突变/野生型LINC00355及CCNE1片段载体。双荧光素酶报告基因实验验证miR-195与CCNE1及LINC00355的靶向关系。10.RNA pull-down及RIP实验进一步验证LINC00355与miR-195的结合以及是否存在于相同的RISC复合体。11.细胞培养并分为Blank组、NC组、sh-LINC00355组、miR-195 mimic、miR-195 inhibitor、miR-195 inhibitor+sh-LINC00355组。RT-PCR检测各组细胞转染后LINC00355、miR-195、CCNE1的表达;Western Blot检测各组增殖、周期及凋亡相关蛋白的表达。12.EDU实验、克隆形成实验、细胞周期及裸鼠成瘤实验检测转染后各组细胞增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。13.采用SPSS22.0统计分析软件对实验数据进行分析,P<0.05说明结果具有统计学意义。结果:1.生物信息学预测LINC00355/miR-195/CCNE1靶向关系并分析三者的表达。从pubmed GEO公共数据库下载肺腺癌全基因组芯片GSE43458数据,CCNE1为差异表达最显著的mRNA,利用TCGA数据库进一步证实CCNE1在肺腺癌中高表达,且与不良预后相关。生物信息学预测得出miR-195可作为与CCNE1相互作用的靶miRNA,进一步预测发现长链非编码RNA LINC00355能够与miR-195靶向结合,并且TCGA数据库分析提示LINC00355在肺腺癌中高表达,miR-195呈低表达,相关性分析显示miR-195表达水平与CCNE1、LINC00355表达均呈负相关。2.分别在肺腺癌组织及细胞系中验证LINC00355的表达。收集辽宁省肿瘤医院103例肺腺癌术后组织学标本,RT-PCR检测LINC00355表达,相比癌旁正常肺组织,LINC00355在肺腺癌组织的表达水平明显升高,这些发现与芯片GSE43458中的结果一致。此外,肺腺癌组织中LINC00355的表达与性别、年龄、有无吸烟史无明显关系,而与肿瘤直径、淋巴结转移及TNM分期相关。RT-PCR检测肺癌细胞株及正常肺上皮细胞HBE中LINC00355、miR-195及CCNE1表达水平,结果显示LINC00355和CCNE1在肺癌细胞株中的表达量高于HBE正常肺上皮细胞,miR-195在肺癌细胞株中的表达量低于HBE正常肺上皮细胞。3.干扰LINC00355可抑制肺腺癌细胞的增殖。EDU法检测结果显示,与NC组比较,sh-LINC00355组细胞增殖较慢。细胞克隆形成实验结果显示与NC组比较,sh-LINC00355组细胞克隆形成能力明显下降。流式细胞术检测细胞周期结果提示干扰LINC00355后细胞出现G1/G0-S期细胞周期阻滞。采用Annexin V FITC/PI双染色方法对干扰LINC00355后进行细胞凋亡分析,结果显示sh-LINC00355组相较于对照组,细胞凋亡比例明显增加。Westernblot检测发现干扰LINC00355后,肺腺癌细胞中CDK6、PCNA、Cyclin-D1和Bcl-2的表达水平均显著下降,而Bax的表达则显著上调。4.LINC00355/miR-195/CCNE1靶向关系的验证。在A549细胞中进行FISH实验证实LINC00355主要存在于细胞浆,通过生物信息学预测miR-195与LINC00355及CCNE1存在共同结合位点。荧光素酶报告基因结果提示,与包含突变型LINC00355及CCNE1片段的荧光素酶报告基因载体相比,过表达miR-195可以使野生型载体组的荧光素酶活性明显下降,提示miR-195与LINC00355及CCNE1存在直接靶向关系。RNA pull-down实验表明,与MUT-miR-195对比,WT-miR-195结合的LINC00355明显增加,再次验证miR-195和LINC00355可以直接结合。RIP实验结果进一步提示Ago2免疫复合物中LINC00355和miR-195的表达水平明显高于Ig G组,提示非小细胞肺癌细胞中LINC00355和miR-195可能存在于相同的RISC复合物中。5.LINC00355负性调控miR-195,正性调控CCNE1,且对CCNE1的调控依赖于miR-195。为进一步验证LINC00355、CCNE1及miR-195三者之间的调控关系,我们首先利用RT-PCR分别检测Blank组、NC组、miR-195 mimic组、miR-195inhibitor组、sh-LINC00355组及miR-195 inhibitor+sh-LINC00355组中LINC00355、CCNE1及miR-195的表达,提示干扰LINC00355可上调miR-195表达,下调CCNE1表达。此外,将6组细胞分别进行EDU实验、细胞克隆形成实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验、体内成瘤实验并进一步利用Western Blot检测增殖、周期及凋亡相关蛋白的表达,结果显示,下调LINC00355或过表达miR-195均可抑制A549细胞的增殖,而下调miR-195可逆转敲减LINC00355对A549细胞的增殖抑制作用。结论:1.LINC00355在肺腺癌中高表达并与患者不良预后明显相关;2.体内外实验证明了LINC00355可促进肺腺癌细胞的增殖;3.miR-195与LINC00355及CCNE1存在直接靶向关系;4.LINC00355负性调控miR-195,正性调控CCNE1,且LINC00355对CCNE1的调控依赖于miR-195。因此,综上实验结果证实LINC00355通过下调miR-195上调CCNE1的表达促进肺腺癌细胞的增殖。