猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)是一种引起猪群发性呼吸道疾病的病原,其基因组由8条分节段的负链RNA构成,共编码10种蛋白质。NS1蛋白是其中唯一的非结构蛋白,因其保守性和抗原性,在自然感染与疫苗免疫的鉴别诊断、流行病学调查、流感预测等方面具有重要的应用价值。实验选取A/Swine/Guangdong/99(H3N2)猪流感病毒株作为研究对象,从鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,根据已发表的A型流感病毒的核苷酸序列,设计一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功地扩增了实验毒株的NS1基因。将NS1基因的cDNA克隆后进行了序列测定,结果表明,所扩增的778 bp片段包含了完整的NS1基因的开放阅读框(ORF)。将实验毒株与www.flu.lanl.gov网站下载的11株参考毒株进行序列比较分析,结果表明,实验毒株与参考毒株核苷酸序列的同源性为91.7%~96.8%,推导出氨基酸序列的同源性为90.4%~96.8%,说明NS1基因在进化上具有较高的保守性,遗传稳定;实验毒株NS1蛋白的C末端缺失2个氨基酸,与其他毒株不同。系统进化树分析表明,实验毒株属于等位基因群A群;与香港分离株Sw/HK/82的进化关系最为密切,属于同一个进化小分支;与美国分离株的遗传关系相对较远,说明H3N2亚型猪流感的发生和流行与地域有一定的相关性。重组质粒pMD18T-NS1和杆状病毒转移载体pFast Bac经EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后,将NS1基因亚克隆到转移载体pFast Bac中,转化宿主菌DH10 Bac,经PCR鉴定和酶切鉴定后筛选出阳性克隆。序列测定证实目的基因正确插入载体,可用于下一步的表达,构建成功的真核表达质粒命名为pFastBac-NS1。