论文部分内容阅读
急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是由于败血症、肺炎、吸入胃肠道内容物,外伤和其他一些临床疾病引起的肺实质病变,导致的急性低氧性呼吸功能不全,可起病于任何年龄的患者。病情严重的急性肺损伤可进一步发展,成为急性呼吸窘迫综合症(ARDS),甚至演变成为多器官功能障碍综合征(MODS),急性肺损伤的病死率高达44%以上。新生儿由于肺组织发育不成熟,对外界损伤刺激抵御能力差。新生儿期由于重症感染、损伤,临床表现为进行性呼吸困难、肺部湿啰音、咳出粉红色泡沫痰,新生儿由于肺血管基膜结构较薄,易引发肺出血,后果更加严重。所以对新生儿急性肺损伤预防的研究具有重要的临床意义。目前,有国外学者发现,缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在急性肺损伤的发病过程中起到了重要的作用。本研究拟通过内毒素(LPS)腹腔注射给药的方法,制作新生大鼠急性肺损伤的动物模型,并通过盐酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride, PHC)在内毒素腹腔注射给药前进行干预处理,观察其对相关介质的影响作用,并通过对肺组织病理学的观察,探讨盐酸戊乙奎醚在急性肺损伤新生大鼠中的保护作用机制,以及该保护作用与缺氧诱导因子-1α表达的关系。为新生儿ALI的临床防治提供新的理论依据。目的探讨盐酸戊乙奎醚对内毒素(LPS)致急性肺损伤(ALI)新生大鼠的保护作用以及该保护作用与缺氧诱导因子-1α (HIF-la)表达的关系。为新生儿急性肺损伤的临床防治提供新的理论依据。材料与方法1.研究对象24只健康7日龄新生SD大鼠,体重17～22g,雌雄不拘,购买于郑州大学医学院河南省实验动物中心。2.实验方法2.1动物模型的制作采取腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的造模方法,制作新生大鼠内毒素致急性肺损伤的动物模型。把LPS稀释,以3mg／kg的剂量,以lml注射器下腹部腹腔注射。注射后将大鼠放回笼内,在LPS注射后6小时,将各组动物用350mg／kg水合氯醛腹腔注射麻醉后,开胸采取肺组织标本。依据光镜下肺组织病理学的改变以及炎症指标,可对新生大鼠ALI动物模型的成功建立进行确定。2.2动物分组将24只健康7日龄SD大鼠,采用随机数字表法分为三组(n=8)：①空白对照组(C组),腹腔注射生理盐水0.3m1②肺损伤组(ALI组),依LPS3mg/kg的剂量稀释至0.3m1腹腔注射③盐酸戊乙奎醚组(P组),在注射3mg/kg LPS0.3m1前半个小时,腹腔注射盐酸戊乙奎醚2mg／kg。2.3肺组织的标本采集将左肺组织电子称重记录湿重后置于70。C烘箱72小时烘干,用于测量湿／干重比值。将右肺上叶用DEPC水冲洗干净后,放置冻存管封存,放置至-80冰箱保存,待用于RT-PCR检测。将右肺后叶置入4%甲醛溶液内浸泡24小时,进行固定。将固定好的肺组织进行石蜡包埋、切片,并用不同浓度酒精进行梯度脱水,待用做HE染色光镜观察。将右肺下叶取出,制成匀浆液,通过在4℃电子离心机中经过15分钟1800r／min转速离心后,取其上清液,置于-20℃冰箱保存,备以组织匀浆检测用。2.4检测指标2.4.1ELISA法测定新生大鼠肺组织中IL-6、TNF-α、HIF-1α的含量将新生大鼠右肺下叶取出电子称重,按其质量9倍的容积取生理盐水置入匀浆器中,制成匀浆液,通过在4。C电子离心机中经过15分钟1800r/min转速离心后,取其上清液,制备组织匀浆。用ELISA试剂盒检测肺组织匀浆中IL-6、 TNF-α、HIF-1α的含量。2.4.2RT-PCR法测定新生大鼠肺组织中]HIF-1α mRNA的表达将右肺上叶用DEPC水冲洗干净滤纸吸干后,快速经液氮冷却。经过HIF-1α、 GAPDH mRNA引物的设计与合成、提取大鼠肺组织总RNA、RNA逆转录、PCR扩增HIF-1α、GAPDH以及琼脂糖凝胶电泳后检测新生大鼠肺组织中HIF-la mRNA的表达变化。2.4.3测定新生大鼠肺组织湿／干重比值(W／D)将左肺组织,滤纸吸干其水分,经电子称重后记录湿重值,然后置于70℃恒温烘干箱烘烤72小时,使肺组织干重的质量不再发生变化。测定并记录肺脏干重,计算出肺湿／干重比值(W／D)。2.4.4新生大鼠肺组织学检查取右肺后叶制成厚度为5um的石蜡切片,行HE染色。用于光镜下肺组织组织形态变化的观察。3.统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差(x±s)来表示,使用单因素方差分析进行各组间的比较,使用Student-Newman-Keuls法(q检验)进行均数两两比较。检验水准a=0.05。结果1.新生大鼠的一般情况：在LPS腹腔注射后6小时,急性肺损伤组(ALI组)大鼠相比空白对照组大鼠的活动情况有所减少、并出现了呼吸加速的症状,其中部分新生大鼠咳出了粉红色泡沫状痰并表现出紫绀现象。盐酸戊乙奎醚组(P组)的新生大鼠同时也出现了呼吸加快、活动减少的表现,但未发现有咳出粉红色泡沫状痰及紫绀的现象。而空白对照组反应正常,未见以上所述症状。2.新生大鼠肺组织形态学的观察：在光学显微镜下,空白对照组(C组)新生大鼠肺组织结构完整,可观察到正常的肺泡结构、光滑的肺泡壁和均匀的肺泡间隔。急性肺损伤组(ALI组)肺泡壁完整结构破坏,肺泡壁断裂,肺间质弥漫水肿,镜下可见肺泡腔内大量渗出的白细胞和红细胞。盐酸戊乙奎醚组(P组)肺泡结构较为完整、肺间质水肿渗出物较ALI组明显减轻。3.与空白对照组(C组)比较,急性肺损伤组(ALI组)和盐酸戊乙奎醚组(P组)的新生大鼠肺W／D比值升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与急性肺损伤组(ALI组)比较,盐酸戊乙奎醚组(P组)的新生大鼠肺组织W／D比值降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.与空白对照组(C组)比较,急性肺损伤组(ALI组)和盐酸戊乙奎醚组(P组)的新生大鼠肺组织IL-6、TNF-α以及HIF-1α的含量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)；与C组比较,急性肺损伤组(ALI组)和盐酸戊乙奎醚组(P组)的肺组织中HIF-1αmRNA的含量明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)；与急性肺损伤组(ALI组)比较,盐酸戊乙奎醚组(P组)的新生大鼠肺组织IL-6含量、TNF-α、HIF-1α和HIF-1α mRNA的表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论戊乙奎醚对新生大鼠内毒素性急性肺损伤具有保护作用,其机制可能是通过降低HIF-1α的表达,降低炎症反应程度,从而缓解ALI的病情进展。