血友病B(hemophilia B)是人凝血IX因子(human clotting factor Ⅸ, hFⅨ)缺乏所引起的一种出血性疾病。基因治疗是遗传型疾病根本的治疗方法。然而遗传病基因治疗的应用依然面临两难的局面。免疫原性风险[1-4]和遗传安全性[1-4]为其应用中首先需要解决的问题。在前期成功使用rep-RBE定点整合转基因方法通过小鼠尾静脉注射方法获得hFIX长时间表达的实验基础上,本研究构建一种含CMV启动子-RBE元件-TK1基因的筛选标记的人凝血因子IX表达框架的质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EFlα-hFIXml。该质粒和rep表达质粒共转染哺乳动物细胞可用于构建定点整合于AAVS1位点表达人类凝血因子Ⅸ的稳定细胞。特点为：携带有RBE顺式元件可以介导rep蛋白依赖的AAVS1位点整合；Neo正筛选基因可以用G418筛选获得整合细胞；RBE元件位于TK1基因和启动子之间,可以用阿昔洛韦去除没有RBE参与的非定点整合细胞；最后获得定点整合于AAVS1位点稳定表达人凝血因子IX的细胞。使用该质粒制备稳定表达人类凝血因子IX的稳定细胞,一方面正负双重筛选可以防止细胞随机突变导致的非整合细胞耐药对转基因细胞群纯净度的影响,提高表达效率；另一方面可以有效预防插入突变导致的基因突变和癌蛋白表达风险。通过常规分子生物学方法取代人类凝血因子IX表达框架可以构建表达其它基因的具有定点整合以及正负筛选的质粒。目的：筛选靶向调控ZNF403基因的microRNAs。方法：利用生物信息学miRNA靶基因预测软件miRWalk,预测能调控ZNF403的miRNAs。构建ZNF403基因3’UTR荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶活性测定,初步分析可能调控ZNF403基因表达的niRNAs。使用Real-time PCR方法,在mRNA水平检测miRNAs对ZNF403基因表达的调控作用。结果：]miRNA靶基因预测软件miRWalk针对ZNF4033’UTR预测能调控ZNF403的miRNAs有65个；根据生物信息预测结果和文献分析筛选出4个miRNAs:miR-23, miR-135, miR-199, let-7。然后针对这4个候选miRNAs与ZNF403 3’UTR荧光素酶报告质粒共转染HEK293细胞,双荧光素酶活性测定结果显示实验组与对照组无显著差异,无统计学意义。Real-time PCR结果与荧光素酶实验结果一致。结论：niR-23, miR-135, miR-199, let-7g对ZNF403没有抑制功能,ZNF4033’UTR不存在这4种microRNA的靶点。后期促进复合体／细胞周期体(Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome, APC/C)是一种泛素连接酶,在有丝分裂结束时以及细胞周期G1期,APC/C靶向细胞周期调节蛋白的降解[1,2]。共激活因子Cdc20结合到关键有丝分裂底物上,经APC/C将其泛素化而诱导降解。Sp100作为PML-NBs结构的重要组成蛋白,参与了抗病毒,转录调控,细胞凋亡等重要的细胞活动。我们先前的研究发现Cdc20介导Sp100通过泛素-蛋白酶体途径降解,且Sp100中的D-box在底物识别过程中具有重要作用。然而,在PML和DAXX中都存在典型的D-box序列,但是,这两种蛋白都不能被Cdc20所识别降解,提示了D-box可能还需要一些特异性的侧翼序列才能被Cdc20识别,而且Sp100的D-box在物种问并不保守。本研究中,我们构建了一系列含D-box的Sp100截断体和点突变来探讨Cdc20底物识别的必要序列。研究发现GFP-Sp100(152-182 aa)截断体包含D-box但是不能被APC/C-Cdc20降解。GFP-Sp100(151K→G)突变体将潜在泛素结合位点突变后,Sp100降解显著受到抑制。但是,远离D-box的潜在泛素化位点破坏后对Sp100降解没有影响。我们的结果表明,Sp100蛋白中D-box附近泛素化位点(151K)在Cdc20介导的蛋白降解中是必要的。