研究背景椎间盘退变性疾病是骨科最常见病种之一，不仅为患者及家庭带来了痛苦，也给社会造成了极大的经济负担。椎间盘退变过程中，椎间盘组织显示出明显的组织结构学改变，比如髓核组织脱水、细胞死亡、纤维环断裂及终板软骨钙化变薄等。与此同时，椎间盘内的营养代谢也发生了显著改变，目前研究证实，在椎间盘退变过程中，髓核细胞的死亡与营养代谢有着密切关系。BNIP3蛋白是目前已知的与营养代谢有关的促细胞死亡蛋白之一，通常情况下在细胞内不表达或低表达，当细胞应激时，BNIP3蛋白表达上调，并与线粒体外膜相结合，导致线粒体膜电位丧失、通透性增加、线粒体内促死亡蛋白释放，最终诱导细胞死亡。凋亡诱导因子(AIF)是目前已知的诱导非经典性细胞死亡的蛋白之一，正常情况下存在于线粒体基质内，当线粒体外膜通透性增加，AIF从线粒体内释放并转位细胞核，导致细胞核发生大片段DNA断裂。因此，我们假设当椎间盘发生退变时，局部髓核组织内营养代谢发生显著改变，BNIP3蛋白表达异常增加，最终通过经典的和/或非经典的细胞死亡通路导致髓核细胞死亡。目的证实BNIP3蛋白参与了退变性椎间盘髓核细胞死亡，通过抑制BNIP3蛋白表达可以延缓甚至中断椎间盘髓核细胞死亡，由此阻止椎间盘退变的进一步发展，为退变性椎间盘疾病的生物治疗提供新的理论依据。方法1．大鼠尾椎间盘髓核细胞的体外分离培养及鉴定取健康SD大鼠尾椎间盘髓核细胞，在含有10%灭活FBS的DMEM/F12培养液中培养，倒置相差显微镜下观察原代细胞形态，爬片培养后进行甲苯胺蓝、HE、聚集蛋白聚糖和II型胶原免疫组织化学染色，透射电镜观察，对髓核细胞体外的生物学特性进行研究。2．BNIP3在退变性髓核细胞中表达的实验研究体外通过营养剥夺（无糖、无血清、低氧）模拟体内椎间盘退变微环境，测定在正常培养环境及营养剥夺培养环境下，髓核细胞死亡率、线粒体膜电位、Caspase酶活性变化以及BNIP3、AIF表达量改变及其细胞内定位。3．髓核细胞BNIP3过表达及抑制实验通过构建慢病毒载体，在髓核细胞内分别过表达及抑制BNIP3蛋白，通过免疫细胞化学及细胞器蛋白定量技术，分析BNIP3蛋白与髓核细胞死亡之间的联系及其机制。4．动物模型实验构建椎间盘退变动物模型，建模后即刻、2周、4周及8周，通过MRI及椎间盘组织学染色评估椎间盘退变效果，利用免疫组织化学及PCR技术，分析BNIP3蛋白表达与椎间盘退变之间的关系。结果1．大鼠尾椎间盘髓核细胞生物学特性1.1大鼠尾椎间盘髓核细胞：1、倒置显微镜下观察，原代大鼠尾椎间盘髓核细胞呈类圆形，体积较大，折光强，5d始有细胞贴壁，细胞呈多角形或短梭形，12d~14d细胞生长进入指数期，约21d时，细胞长满瓶壁，可进行传代；2、大鼠尾椎间盘髓核细胞活力测定，初次分离时细胞活力约95%～97%，原代培养期间，细胞活力维持在98%～100%，第一次传代后，细胞活力仍保持98%~100%；3、大鼠尾椎间盘髓核细胞行甲苯胺蓝染色显示强阳性，HE组织学染色显示细胞核、细胞质着色明显，界限清晰，II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖免疫细胞化学染色呈阳性；4、细胞透射电镜显示原代大鼠尾椎间盘髓核细胞内线粒体少，细胞质内有大量糖原颗粒。1.2通过对大鼠尾椎间盘髓核细胞的培养及观察，原代细胞取材容易，但分离出的细胞较少，生长缓慢，而传代后髓核细胞生长速度加快，数量多，适合进一步实验需要，因此后续实验均采用第一代的髓核细胞进行。2．营养剥夺诱导髓核细胞BNIP3表达及AIF细胞核转位real-time PCR、细胞免疫荧光染色及Western Blot显示对照组细胞低表达BNIP3，蛋白主要位于胞浆，实验组显示随营养剥夺时间延长，BNIP3表达呈上升趋势，在48h明显增加，且BNIP3与线粒体相结合；流式细胞仪检测发现细胞死亡及线粒体膜电位在正常对照组无明显变化，而在实验组随培养时间延长细胞死亡增加、膜电位降低。与此同时，实验组组研究发现，线粒体基质内的AIF蛋白表达虽然未发生明显改变，但AIF逐渐从线粒体基质中释放出来并转移至细胞核内。3．过表达及抑制BNIP3蛋白对髓核细胞的影响3.1通过体外构建慢病毒及RNA干扰技术，实现细胞内BNIP3蛋白过表达及表达抑制，发现：1、BNIP3过表达可急剧降低细胞在退变环境中的生存率，而细胞死亡显著增加；2、通过RNAi抑制BNIP3蛋白表达后，可增强细胞在退变环境下的耐受性，增加细胞活性。3.2BNIP3过表达及抑制实验时，通过细胞器AIF蛋白定量检测发现：1、BNIP3过表达可加速AIF从线粒体内向细胞核转位；2、抑制BNIP3蛋白表达可减缓AIF从线粒体向细胞核内转位，但不能消除，提示BNIP3参与了营养剥夺导致AIF向细胞核转位，但不是唯一的因素。4．椎间盘退变与BNIP3蛋白表达的关系4.1通过穿刺破坏椎间盘纤维环结构建立退变椎间盘动物模型，通过组织学和MRI评分观察，证明手术椎间盘退变效果符合实验应用要求。4.2手术组椎间盘髓核组织BNIP3基因表达检测发现，手术后2周、4周、8周组与对照组相比有显著性差异，且手术后各组间也具有显著性差异。将同一椎间盘髓核组织BNIP3基因表达量与其MRI评分进行Spearman rank correlation test检验，发现BNIP3基因表达与其MRI评分具有显著性相关，rho=0.92, p<0.01。4.3椎间盘髓核组织BNIP3免疫组织化学染色发现，手术后2周、4周、8周组BNIP3表达灰度值与对照组相比有显著性差异，将同一椎间盘髓核组织BNIP3染色灰度值与其组织学评分进行Spearman rank correlation test检验，发现BNIP3染色灰度值与其组织学评分具有显著性相关，rho=0.926, p<0.01。结论1．营养剥夺可在体外诱导髓核细胞表达BNIP3增加，并促进AIF转位细胞核导致细胞发生非典型性死亡；2．病毒转染实验表明，BNIP3过表达可明显增加髓核细胞在营养剥夺时的死亡，但抑制BNIP3表达并不能显著减少髓核细胞的死亡，说明BNIP3虽然参与了髓核细胞退变死亡，但不是唯一的因素；3．动物实验表明体内BNIP3基因的表达与椎间盘退变具有相关性，抑制其表达可能减缓椎间盘的退变，但不能逆转。