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主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)基因是脊椎动物体内与免疫功能密切相关的一个的基因家族,其基因编码的蛋白在调节免疫系统识别自身和异物之间起着重要的作用。MHC变异反映种群内、种群间与进化相关的适应性过程,适合于研究进化生态学和保护学方面的一些问题。 本文鉴定了分布于中国境内鹭科鸟类(ardeidae)的两个经典MHCⅡ类基因(DAB1、DAB2),并设计通用引物分析了鹭科鸟类7属13种的MHCⅡ DAB基因,特别是包含假定的肽链结合区(peptide-binding region,PBS)的第二外显子的序列变异情况,初步研究不同物种序列之间的系统关系。其中较为系统地分析了鹭亚科(ardeinae)受胁物种黄嘴白鹭(Egretta gulphotes)、岩鹭(Egretta sacra)的MHCⅡB DAB1座位变异情况,以及常见种白鹭(Egretta garzetta)MHCⅡB DAB1基因在三个不同地区的遗传多样性情况。通过上述分析,希望能够初步了解这些MHC基因在鹭科鸟类的变异水平,尤其关注那些由选择压力引起的序列变异区域。 本文主要研究结果主要包括下列三个方面: (1)主要组织相容性复合物(MHC)由于长期受到自然选择等作用的影响具有高度遗传多态性的特点,因而能反映物种与环境因素之间的适应性进化关系,适合作为研究进化生态学及保护生物学诸多开放性问题的有效工具。为开发适于研究鹭科鸟类MHC基因遗传多样性的分子工具。我们利用已有的鸟类MHC基因分子信息,用PCR方法在苍鹭(Ardea cinerea)分离鉴定到两种MHCⅡB基因(DNA及cDNA:包含部分第一外显子到部分第三外显子区域,命名为DAB1与DAB2);这两种基因符合经典的MHCⅡB结构特征。在此基础上,进一步设计通用引物用于扩增13种鹭科鸟类此二类MHCⅡB基因第二外显子与第二内含子序列,总共93个等位基因被鉴定。建立在第二外显子基础上的系统关系显示:这两个基因分为两个不同支链,暗示着每个基因执行功能上可能存在区别。在每个分支上,来自不同种内的一些第二外显子序列比同一种内序列更为接近,同时一些共享等位基因被发现,这些都支持MHC跨物种进化学说。在第二内含子到部分第三外显子序列基础上的系统关系显示两个基因是根据种类聚支,显示着协同进化。最后,基因转换分析显示基因转换发生在在鹭科MHC进化过程中。 (2)由于MHC是与机体自身免疫应答紧密关联,较高的多样性水平有助于物种面对外部病原的入侵,提高适应环境和生存繁衍的能力,因此MHC的高度多态性水平是物种生存力的一个重要指标。本研究选择了中国大陆三个不同地理位置(河南、贵州、福建)的白鹭种群,初步研究在MHCⅡB DAB1基因是否存在分化。研究结果如下:在这个常见种中发现了丰富的MHCⅡB DAB1等位基因数量(55个不同等位基因发现于73个个体),其序列变异分析显示抗原结合位点上的非同义突变替换率高于同义突变替换率(dN/dS:1.99,P<0.05),显示历史上白鹭DAB1基因经历过正选择作用。CODMEL程序中的模型M7和M8似然比检测(Likelihood ratio test,LRT)结果同样支持上述推论。进一步利用经验贝叶斯法准确地检测出15个受正选择作用的氨基酸位点,其中9个处于假设的抗原结合位点上,因此正选择可能是维持白鹭DAB1基因多态性的主要机制之一。在系统分析方面,系统树的分析结果显示河南种群趋向独立分支。分子变异分析(analysis of molecular variance,AMOVA)显示出种群间显著的MHC基因分化((O)ST=0.296,P<0.0001);遗传距离与地理距离相关性分析显示不显著(P=0.838)。可见,如果某地区识别当地重要病源的MHC优势等位基因受到选择,这种选择可能使不同区域的种群MHC产生分化。 (3)为了解鹭科受胁物种(黄嘴白鹭和岩鹭)适应环境的潜力,本研究使用MHCⅡB DAB1基因多态的第二外显子序列,通过单链核苷酸多态反应和序列测序进行分析。结果显示,在30个黄嘴白鹭个体中发现19个不同序列,9个岩鹭个体中发现8个不同序列;岩鹭单个个体拥有2不同序列,暗示着黄嘴白鹭MHC中发生明显的基因拷-3个不同序列,黄嘴白鹭单个个体拥有6-10个贝现象。与常见种白鹭相比,序列多样性研究显示两个物种的MHCⅡB DAB1基因并没有展示出低的多样化水平(核苷酸多样性Pi值分别为:黄嘴白鹭0.0798,岩鹭0.0756)。在两个物种序列突变分析中,在抗原结合位点上的非同义突变替换率均高于同义突变替换率(dN/dS:黄嘴白鹭2.21、岩鹭2.37),氨基酸替换也趋向集中在抗原结合位点(抗原结合位点替换率/非抗原结合位点替换率:黄嘴白鹭0.2882/0.0705,岩鹭0.2288/0.0873),提示抗原结合位点上的MHCⅡB DAB1第二外显子基因受到正选择作用。最后,基于两个物种MHC同源序列构建的系统分析结果显示,MHCⅡB DAB1第二外显子基因序列未根据物种关系聚类,支持MHC的跨种进化学说。 本研究首次调查了13种鹭科鸟类在适应性标记MHC基因上的序列变异及进化关系,以期为鹭科鸟类保护遗传学和免疫遗传学提供一定的理论基础,本论文从组织相容性复合物角度研究中国境内鹭科鸟类的遗传多样性及其分子进化,为后续相关研究奠定工作基础。