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柑橘是目前世界上栽培最多的果树,具有重要的商业价值和科学研究价值。自柑橘属确立以来,柑橘的分类和进化问题开展了众多研究,但在某些类群关系或材料的分类上至今仍无定论。叶绿体基因组为细胞质遗传,结构稳定,遗传进化相对保守,能保留较多进化中积累的变异。对叶绿体基因组开展研究,有利于从细胞质层面揭示柑橘及其近远缘属的亲缘关系和演化过程,为柑橘种质资源分类鉴定和育种评价提供理论依据。本研究以柑橘及其近远缘属植物作为试验材料,从叶绿体基因组分子标记和克隆测序两方面展开,利用分子标记揭示柑橘及近缘属植物间的遗传差异,利用高变区克隆测序探究柑橘及近远缘属植物的亲缘关系和演化过程。主要研究结果如下:1.基于叶绿体基因组分子标记的研究1.1 cpInDel标记和cpSSR标记的开发参考甜橙叶绿体基因组,对14个代表性柑橘类型进行叶绿体基因组高变异区序列组装,比较分析发现4个存在明显差异的In Del位点,根据差异In Del位点成功设计4对cpInDel引物,命名为HVar-cp INDEL。利用MISA（Microsatellite identification tool）检测甜橙叶绿体基因组的SSR位点,Seqkit对由两个及两个以上核苷酸重复构成的SSR位点定位,发现13个在不同类别间存在差异的SSR位点,据此设计13对cpSSR引物。1.2 cpInDel标记和cpSSR标记的遗传多样性分析采用新开发的标记和已发表具多态性的cpSSR标记,对48份柑橘及近缘属开展遗传多样性分析。新设计的cpInDel和cpSSR引物在本试验材料中能100%检测到多态性,已发表的cpSSR标记仅有66.7%。与cpInDel相比,cpSSR标记中产生的多态性条带更多。cpInDel引物共扩增出21条多态性条带,平均每对引物可检测到5条多态性条带,扩增片段范围为178 bp～491 bp。标记基因多态信息含量（PIC）变化范围为0.24～0.69,平均值为0.47。cpSSR引物共扩增112条多态性条带,平均每对引物可检测到6条多态性条带,扩增片段范围为160～349 bp,基因多态信息含量（PIC）变化范围为0.04～0.80,平均值为0.55。对cpInDel标记和cpSSR标记电泳谱带进行分析,发现通过差异谱带可有效区分试验材料。研究结果显示,在进行类群区分时,特别是在属层面的区分上,cpSSR标记区分效果不及cpInDel标记。对cpInDel和cpSSR标记进行聚类分析,两者得出比较类似的聚类结果,但在小类群关系以及部分材料的归类上存在差异。二者均将宽皮柑橘类、柚类、真正枸橼类、真正枳类和金柑类聚类为相应类群,揭示均归类于柑橘属枸橼类的香橼与柠檬、藜檬和梾檬,以及均归类于枳属,具有三出复叶的枳与枳杂种,两个类群内部有差异明显的胞质;显示宽皮柑橘类黄柑的代表性品种旺苍皱皮柑有不同于宽皮柑橘类其他品种的胞质来源;虽都名为香橙,但资阳香橙和韩国香橙可能有不同的胞质来源。对宽皮柑橘类、甜橙-酸橙类和宜昌橙-大翼橙类3个小类群的相互关系,cpInDel显示它们关系较近,而cpSSR则将它们归为独立的类群。cpInDel标记将印度野橘归于真正的枸橼类,cpSSR将其单独聚为一类。2.基于叶绿体基因组高变区克隆测序的研究选取分子标记研究中具有种群代表性和电泳条带呈现差异的柑橘及近缘属材料32份、具有代表性的柑橘远缘属材料8份,对3个叶绿体基因组高变区序列进行克隆测序,整理获得各材料的代表性序列数据120条。采用MEGA对整理后的序列进行UPGMA聚类分析,聚类结果显示,在遗传距离0.0014～0.0015之间,将所有材料分为18个类群,其中8个柑橘远缘属材料,4类柑橘近缘属材料以及柑橘属的3个基本种分别聚类到柑橘远缘属、近缘属以及柑橘属类群,一般归类于宽皮柑橘类的贺州姑婆山野柑、印度野橘以及归类于大翼橙-宜昌橙类的红河大翼橙均聚为独立小类群。对序列进行手动比对,发现高变区2区域序列变异相对较小,一般为SNP或仅在某一类群或几个类群中特有的较短In Del;而高变区1和高变区3不仅有SNP,还包括在所有类群中均存在且在类群间呈现一定规律性变异的较长In Del。在高变区1中存在两个呈规律性变异的位点,其变化特点与所在材料在传统研究里所处的进化层次表现出一定的契合性。由此以高变区1序列变异情况为主,高变区2和3作为补充,开展柑橘属及近、远缘属植物演化研究。高变区1存在两个较长In Del变异位点,分别为变异位点1和变异位点2。变异位点1存在中部和3’端的多种变异类型,在3’端的变异类型分别为TTAG、TTAC、TGAC、GGAC,其中含TTAG序列的材料为被认为更原始的柑橘远缘属植物花椒和飞龙掌血,因此推论TTAG序列可能较其他序列类型更为原始;中部的变异类型可归类为Poly A类型和Poly A间插其它碱基类型,难以判断其演化规律但可用于类型间的鉴定。变异位点2根据有无AGAA序列可将所有试验材料分为两类,其中无AGAA序列的材料中包含更多前人研究认为更为原始的柑橘近、远缘属植物,如花椒、飞龙掌血、山黄皮、调料九里香、澳沙檬、金柑属、真正的枳属等,由此认为不存在AGAA序列的可能更原始;含AGAA的材料可以进一步划分为三类,AGAA前无ATATTCTCT或对应反向互补序列AGAGAATAT的为一类,包括黄皮、酸橙和柠檬等,AGAA前有ATATTCTCT为一类,包括九里香、宜昌橙、宽皮柑橘等,AGAA前有AGAGAATAT为一类,包括莽山野柑、柚和甜橙等。3.叶绿体基因组分子标记和高变区序列克隆测序研究比较叶绿体基因组高变区序列克隆测序结果显示电泳检测中存在长度差异的片段,其对应序列确实存在差异,另外无长度差异的片段中也存在碱基序列的差异尤其是SNP差异。通过不同材料中克隆测序序列的长度差异以及内在的In Del和SNP组合差异,可对各类群进行分离。克隆测序序列聚类分析得到与分子标记多态性分析较为一致的聚类结果,但在印度野橘、红河大翼橙、莽山野柑和贺州姑婆山野柑的归类上存在差异。基于克隆测序数据的聚类,不仅能对大类群进行有效划分,对小类群的划分效果也较好。综上,本研究采用二代测序数据组装和含特征片段的读序频率分析方法,高效率开发获得cp Indel和cpSSR两种分子标记共17个。新开发的分子标记和叶绿体基因组高变区克隆测序均能比较高效地区分和鉴定柑橘种质材料;聚类结果较为一致,获得了与基于形态的传统分类学大类群相似的结果,但也发现传统分类学大类群内胞质来源差异较大。通过高变区克隆测序序列,可开展柑橘演化研究,据高变区1两个呈规律性变异的位点推断出含TTAG序列和不含AGAA的序列可能较其他序列类型更为原始。