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3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)是拟除虫菊酯类农药降解的中间产物。从结构上看,它是二苯醚的衍生物,结构非常稳定。研究其降解调控机制,有助于完整解析拟除虫菊酯类农药的微生物降解途径与机制,构建代谢网络,进而也为菊酯类农药残留的微生物修复供理论基础。从基础研究方面来看,对调控机理的解析可以拓展对微生物生理代谢过程的理解,丰富代谢调控的理论基础。本实验室前期的研究中,分离到一株拟除虫菊醋矿化菌株Sphingobium wenxiniae JZ-1T,并先后从其中克隆鉴定了菊酯水解酶基因pytH和3-PBA 1’,2’-双加氧酶基因簇pbaA1A2BC,PytH催化菊酯生成二氯菊酸和3-PBA,该基因是组成型表达;pbaA1A2BC基因簇编码的角度双加氧酶催化3-PBA生成3-羟基苯甲酸和儿茶酚。在克隆pbaA1A2BC基因簇的过程中发现该基因簇和pytH不同,它并非组成型表达,而是受底物3-PBA的诱导,这一结果表明JZ-1T中存在对3-PBA特异响应的转录调控机制。基于此结果,本文对3-PBA微生物降解过程的转录调控分子机制进行研究。本研究意义在于深入理解细菌降解3-PBA的过程机制,利于菌株资源更加有效地运用;同时在理论上拓展对细菌分解代谢调控方式的了解。1.Sphingobium wenxiniae JZ-1T中pbaA1A2B基因襄转录激活蛋白PbaR的鉴定首先,以菌株Sphingobium wenxiniae JZ-1T为实验材料,对其中的pbaA1A2B以及pbaC基因的转录单位进行了鉴定,结果表明pbuA1,pbaA2和pbaB处于同一个转录单元中,pbaC则是另外一个独立的转录单元。运用引物延伸实验确定了其转录起始位点,pbaA1A2B的转录起始位点为起始密码子上游48碱基处的"A",pbaC基因的转录起始位点为起始密码子上游33碱基处的"C"。运用软件对pba基因簇启动子区域的DNA元件进行了预测,包括-10 box,-35 box以及核糖体结合位点等。运用DNA affinity的方法纯化得到pbaA1A2B启动子DNA的特异性结合蛋白,得到的蛋白经过SDS-PAGE电泳后将其中4条小于35 kDa的蛋白条带切割出来进行了MALDI-TOF/TOF质谱鉴定,鉴定肽段与菌株基因组信息比对后发现其中有一个条带的蛋白为IclR家族的转录调控因子,因此推测此蛋白为调控pbaA1A2B基因簇转录的调控因子,命名为PbaR。对编码PbaR蛋白的基因进行了敲除,敲除后的菌株失去了以3-PBA为唯一碳源进行生长的能力,而回补进pbaR基因后,相应的菌株又恢复3-PBA同化能力。荧光定量PCR结果显示pbaR基因敲除后pbaA1,pbaA2和pbaB基因的转录较野生菌JZ-1T明显下降,同时也失去了对3-PBA诱导的响应,而pbaR回补菌株恢复了野生菌的特性,这些结果表明pbaR编码一个转录激活蛋白,对3-PBA产生响应进而激活pbaA1A2B基因簇的表达。实验结果同时表明,pbaR的缺失对pbaC基因的转录并没有显著的影响,说明PbaR并不调控pbaC基因。将pbaR在大肠杆菌中大量表达并纯化,纯化的PbaR与pbaA1A2B以及pbaC启动子DNA进行体外结合实验,凝胶阻滞的结果显示PbaR可以与pbaA1A2B的启动子DNA结合但不能与pbaC基因的启动子结合,而且这种结合是不依赖于底物3-PBA的。DNaseⅠ足谱印记实验表明PbaR与pbaA1A2B启动子DNA上的一段29-bp模块结合,该DNA序列中存在一个10-bp的回文序列,破坏回文结构后,PbaR就不能与相应的DNA结合,说明该回文序列在PbaR的识别中起到重要作用。对10 bp回文序列周围的DNA进行突变后,PbaR与相应DNA能够形成复合体,但是形成的复合体不稳定,表明29-bp模块中回文结构周围的序列起到稳定PbaR结合的作用。PbaR与IclR家族调控蛋白有很多相同点,但是其与DNA的结合方式与已报到的其他蛋白有明显差异。第一:其结合位点位于转录起始位点与起始密码子之间,该区域通常是转录阻遏蛋白的结合位点;第二:该序列中只有一个回文序列结构,而该家族其他蛋白有很多是存在2-3个重复序列的结合模式;第三:回文序列周围的DNA碱基对稳定转录蛋白的结合非常重要。PbaR的发现拓展了对该家族蛋白调控模式的认知。2.细菌分解代谢转录调控因子基因组筛选系列质粒pSRGFP-X的构建同时本研究中分离到一株3-PBA降解菌株Sphingobium sp.TP316,其降解3-PBA的基因以及pbaR基因与上述的JZ-1T菌株的100%相似,对其降解特性研究发现TP316在有果糖和3-PBA同时存在的培养基中会发生二次生长现象,这预示菌株TP316在降解3-PBA过程中可能存在分解代谢物阻遏的机制。依据苯甲酸降解的文献报道,猜测调控pbaA1A2B基因簇的PbaR的编码基因受到另外一个转录因子的调节。而通过上面的DNA affinity的方法并没有鉴定到可能的调控蛋白。因此为了寻找到调控pbaR基因的转录调控因子,构建了转录调控因子正向筛选系列质粒pSRGFP-X。该质粒的工作原理是在报告基因egfp前面连入研究基因的启动子序列,运用相应的质粒构建基因组文库,基于转录调控因子与启动子DNA之间的转录调控关系,筛选荧光差异转化子,得到阳性克隆。运用菌株Pseudomonas putida KT2440中已经报道的激活型benR-benABC以及阻遏型nicR-nicC调控系统对构建的pSRGFP-18质粒进行验证,结果表明构建的质粒符合设计要求,可以运用到转录调控蛋白基因的筛选中。3.pbaR基因的转录调控因子CbpR可能介导3-PBA降解过程的分解代谢物阻遇调节。运用上面构建的pSRGFP-18质粒筛选TP316菌株中pbaR基因的转录调控因子,得到一个阳性转化子515-23,对其插入片段序列的分析显示其中存在一个Crp/FNR家族转录因子基因,命名为CbpR。将cbpR基因敲除后,pbaR基因的表达与培养基中果糖的有无失去了相关性,其表达量在不同碳源的培养基中无显著性差异,而回补cbpR后,3-PBA为唯一碳源时pbaR基因则又恢复上调,一旦额外添加果糖,其表达就被抑制,说明回补菌株恢复了野生菌的代谢阻遏表型。pbaA2的表达表现出与pbaR类似的情况。这些结果说明cbpR编码一个pbaR基因的转录激活因子,而它对培养基中缺乏优先碳源(果糖)产生响应。凝胶阻滞实验表明在体外,纯化的CbpR可以与pbaR的启动子结合,当不添加cAMP时,它们以寡聚体形式存在,而添加cAMP后则会形成多聚体形式。推测CbpR在没有cAMP结合的情况下可能会结合在pbaR的启动子区域起到转录阻遏作用,而一旦结合了cAMP则变成转录激活因子。DNaseⅠ足谱印记表明CbpR与pbaR启动子中一段23-bp的序列结合,该段序列与大肠杆菌中同源蛋白CRP的结合位点具有一定的相似性,表明CbpR结合位点可能具有保守性。所以CbpR可能是一个cAMP结合蛋白,它可以对培养环境中是否存在优先碳源产生响应,调控pba基因簇转录激活因子基因pbaR的转录表达,在果糖充足时,细胞内cAMP含量很低,CbpR阻遇pbaR的转录,而当果糖消耗完之后,细胞内cAMP浓度增加,cAMP-CbpR则会激活pbaR基因的转录,表达的PbaR再对3-PBA产生响应从而激活pbaA1A2B基因簇的转录表达,这就是菌株TP316中果糖阻遏3-PBA分解代谢现象产生的原因。综上所述,本文克隆鉴定了菊酯降解菌Sphingobium wenxiniae JZ-1T中3-苯氧基苯甲酸降解基因簇pbaA1A2B的特异性转录激活因子PbaR,PbaR响应3-苯氧基苯甲酸对pbaA1A2B基因簇进行转录激活。论文还分离得到一株3-苯氧基苯甲酸降解菌株Sphingobium sp.TP316,其降解3-PBA存在分解代谢阻遏效应,通过构建的pSRGFP-X系列质粒,筛选到pbaR基因的调控因子CbpR,研究表明CbpR可能介导菌株中3-苯氧基苯甲酸降解的分解代谢阻遏。