论文部分内容阅读
【研究背景】抗体分子可变区上的VH-VL抗原决定簇的总和称为独特型（idiotypic，Id），独特型上的表位被称为独特位（idiotope，Id），它可以刺激机体在自身体内或者异体内诱导相应的抗体，被称为抗独特型抗体（anti—idiotypeantibody，Anti-Id）。 Id和Anti-Id是构成免疫调控网络的主要组成部分,其中由第一抗体Ab1的独特型诱导产生的第二抗体Ab2β型抗独特型抗体，可以作为原始抗原的分子模拟物，也称抗原的内映象（internal image）。研究人员根据Anti-Id的这种特点，通过抗独特型抗体可以获得具有催化作用的抗体，也称抗体酶。纳米抗体是近年来发现的存在于骆驼重链抗体可变区、迄今为止最小的具有功能的抗体片段。在前期研究中，发现可以利用骆驼纳米抗体优先识别酶活性中心的特性，高效获得具有蒜氨酸酶催化活性的抗独特型纳米抗体。这种结构简单的抗体，为研究其催化机制提供了便利条件。同时，在前期研究中利用溶菌酶从VHH抗体库中筛选获得了具有酶抑制活性的Ab1抗体，令人感兴趣的是其中一个纳米抗体NBL42，仅具有一个CDR3区，但却保留了较强的溶菌酶抑制活性。值得进一步研究。【研究目的】为了更好的验证前期研究中提出的基于纳米抗体的抗体酶制备策略，也为了今后进一步阐明抗体酶模拟天然酶的机制，本研究以溶菌酶抑制性纳米抗体NBL42为抗原，对已经构建好的新疆双峰驼免疫噬菌体展示文库进行亲和淘洗筛选，期望获得具有溶菌酶活性的抗溶菌酶独特型抗体，为抗体酶的研究和纳米抗体的分子模拟机制研究提供线索。【研究方法】通过辅助噬菌体滴度的测定，确定抗体库噬菌体滴度。BLAST和DNAMAN软件分析溶菌酶抑制性单域抗体NBL42、NBL114的氨基酸序列。对包含NBL42、NBL114的大肠杆菌宿主菌BL21经过IPTG诱导表达NBL42、NBL114。采用Ni-Sepharose4B亲和层析纯化带His标签的抗体蛋白。SDS-PAGE鉴定纯度，对NBL42、NBL114抗原溶菌酶结合能力采用ELISA进行测定。分别应用NBL42和NBL114作为抗原,对本实验室已经构建好的VHH抗体免疫文库中进行筛选,利用IgG3VHH序列上下游特异引物进行菌落PCR鉴定VHH阳性克隆。引物序列如下VHH-P1:5′-CGCGGATCCGTCCTGGCTGCTCTTCTAC-3′,下游引物VHH-P2:5′-CCGCTCGAGCTTGCATACTTCATTCGTTTC-3′和带有c-Myc标签的引物VHH-P3-IgG3-M:5’-CCGCTCGAGATTCAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTGCTCTGAGGAGAC-3’。阳性克隆经测序证实为VHH抗体后，亚克隆到pET30a构建原核表达载体，诱导表达纯化。SDS-PAGE和Western blot检测纯化的抗体的纯度。ELISA检测与NBL42的特异结合。溶菌酶活性测定采用大肠杆菌进行抑菌检测吸光值的降低。酶活力单位定义为特定条件下，每分钟使吸光度值OD450降低0.001为1个酶活力单位。【研究结果】经测定，辅助噬菌体M13K07滴度为1.24×1013pfu/mL，新疆双峰驼免疫文库噬菌体经一轮扩增后滴度为1.46×1013pfu/mL。成功表达纯化得到溶菌酶抑制性抗体NBL42、NBL114。采用这两种抗体对免疫文库中进行筛选，得到35个IgG3阳性克隆，根据菌落PCR结果选取20个克隆对其DNA序列进行测定，其中5个具有VHH插入片段的克隆，通过NCBI和DNMAN分析测序结果，选择了NBL（1-6）和NBL（2-3）两个克隆用于进行表达和纯化。首先从包含NBL（1-6）和NBL（2-3）两个克隆的重组pCANTAB5E质粒为模板，采用正向引物VHH-P1,反向引物VHH-P3-IgG3-M，进行PCR扩增并连接到pET30a上，构建原核表达载体，诱导表达纯化得到了带有c-Myc标签的NBL（1-6）、NBL（2-3）两个抗体， ELISA和Western blotting分析表明，NBL（1-6）、NBL（2-3）具有较好的抗原结合能力。枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌检测NBL（1-6）和NBL（2-3）的抑菌作用，结果显示NBL（1-6）、NBL（2-3）对大肠杆菌具有一定抑制作用，OD450值分别0.864±0.03和0.889±0.03（重复测定3次），阳性对照溶菌酶对大肠杆菌作用的OD450值为0.855，PBS阴性对照OD450值为1.065。根据酶活力计算公式测出NBL（1-6）酶活为7000U、NBL（2-3）酶活为4200U。【研究结论】采用具有溶菌酶抑制活性的Ab1抗体NBL42，可以从VHH抗体免疫文库中筛选获得抗溶菌酶独特型抗体；其中两个抗体NBL（1-6）、NBL（2-3）能与Ab1抗体NBL42特异结合；筛选获得的抗溶菌酶独特型抗体NBL（1-6）、NBL（2-3）对大肠杆菌具有一定抑制作用，可能具有溶菌酶的催化活性。