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WRKY转录因子是植物最大转录因子家族之一,广泛地参与植物生长发育调控,特别在植物应答逆境胁迫中起重要的调节作用。然而,人们对WRKY转录因子功能的认识还很少,只对少数模式植物中的部分成员进行了初步研究,对于大多数WRKY家族成员的具体功能及其作用机制的仍不太清楚。前人研究发现CaWRKY58在植物免疫反应中起负调节作用,但其具体的分子机制仍不清楚。本研究重点开展CaWRKY58互作蛋白CaSPX的分离与验证,分析CaSPX的功能,并分析CaWRKY58对与CaSPX转录表达的调节作用。主要结果如下: (1)首先实验室早期以CaWRKY58为诱饵,使用酵母双杂交技术并分离得到全长2094bp的cDNA,其中含有特定蛋白结构域,将其命名为CaSPX。通过亚细胞定位发现这个CaSPX分布于整个细胞;蛋白质免疫共沉淀(co-IP)和荧光双分子互补技术(BiFC)结果进一步证实了CaWRKY58与CaSPX的相互作用。 (2)采取外源激素处理结合荧光定量分析方法,发现CaSPX的转录表达受外源脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ETH)和水杨酸(SA)的诱导表达,暗示CaSPX在辣椒应答生物胁迫或者非生物胁迫中可能起到一定的作用。 (3)采用瞬间超表达和病毒诱导基因沉默(VIGS)相结合的方法,对CaSPX在辣椒应答应答病原菌接种中的可能作用进行了分析。结果表明,CaSPX在辣椒植株上瞬间表达使依赖于茉莉酸(JA)信号途径的标记基因-CaDEF、乙烯(ET)途径标记基因CaACO、SA途径的标记基因PR1等表达量上调。相反地,在将目标基因沉默后,辣椒植株抗青枯菌侵染和抗高温转录水平下调,而且还发现检测的SA、JA和ET等途径的辣椒免疫反应相关标记基因表达量均显著下调。这些结果表明CaSPX在辣椒抗病中起重要调节作用,且受SA、JA、ET等信号通路的协调调控。 (4)通过在辣椒植株上的瞬间表达和病毒诱导基因沉默结合荧光定量RT-PCR分析,结果表明:CaWRKY58在辣椒叶片上瞬间超表达可显著抑制CaSPX和CaWRKY6的转录表达。相反地,CaWRKY58沉默则可显著上调CaSPX和CaWRKY6的转录表达;染色质免疫共沉淀(ChIP)分析结果表明,CaWRKY58不仅可与CaSPX启动子中的三个W盒结合,还可与CaWRKY6启动子的三个W-box结合。这些结果表明CaWRKY58可通过与CaSPX和CaWRKY6的启动子直接结合对这些基因的转录表达起负调节作用。 (5)鉴于前人研究发现SPX蛋白在植物应答低磷胁迫中的作用,我们进一步分析了CaSPX在辣椒应答低磷胁迫中的可能作用。结果表明,在低磷胁迫下,磷胁迫标记基因 CaPT1的表达量显著上调,而CaSPX转录表达下调;在CaWRKY58或CaSPX的瞬间超表达辣椒植株中,CaPT1和CaWRKY6均显著下调,而在病毒诱导CaSPX沉默的辣椒植株中,CaPT1和CaWRKY6转录表达则显著上调。这些结果表明在辣椒应答低磷胁迫中起负调节作用。 综上所述,CaSPX在辣椒抗病中起正调节作用,而在辣椒应答低磷胁迫中起负调节作用,该蛋白参与ABA、JA、SA、ET协同介导的信号通路,且受CaWRKY58的负调节。CaSPX与CaWRKY58互作在辣椒应答低磷胁迫中起负调节作用。