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忽地笑(Lycoris aurea Herb)为单子叶石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris)植物。其主要次生代谢产物加兰他敏,传统上是治疗重症肌无力、小儿麻痹后遗症的要药;最新发现其具有阻止乙酰胆碱酶对乙酰胆碱分解的作用,能够逆转失忆,其疗效可达70%,从而可以预防和治疗早老性痴呆症(阿尔茨海默病,AD)。据南方医药经济研究所信息中心统计,加兰他敏的市场销售额增长最大,增幅为500.24%,目前市场上尚未有人工合成品。忽地笑虽然有所栽培,但生长期长,受气候、环境等多方面因素影响,再加上其次生代谢物加兰他敏的含量较低,产品远远不能满足市场的需要,并且价格昂贵。因此利用细胞工程技术对忽地笑进行细胞和组织培养,并筛选高含量加兰他敏细胞系是解决这一问题的途径之一。
本文以忽地笑的鳞茎为外植体,对离体快繁做了初步探讨;研究了不同的物理、化学因子对忽地笑愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖以及次生代谢物加兰他敏形成的影响,从而得出忽地笑愈伤组织诱导、愈伤组织增殖和高含量次生代谢物加兰他敏的培养条件;分析了野生忽地笑中加兰他敏的含量。得出了以下结论:
1、离体快繁时,不定芽诱导最佳培养基为:MS+NAA1.0mg/l+BA15mg/l+KT0.4mg/l;最佳增殖培养基为:MS+BA20mg/l+IBA0.5mg/l;生根培养基为:MS+NAA1.0mg/l+BA0.1mg/l。
2、采用MS、1/2MS以及NH<,4><+>:NO<,3><->不同摩尔比例的改良MS培养基为基本培养基,发现MS<,1>(NH<,4><+>:NO<,3><->=1:25)培养基是愈伤组织诱导和增殖的最佳基本培养基。
3、光照条件有利于愈伤组织诱导,适宜于愈伤组织诱导的生长素为2,4-D和IBA的组合,浓度分别为3.0mg/l和1.0mg/l,细胞分裂素为6-BA,浓度为0.3mg/l。
4、光照条件,愈伤组织增殖培养基为MS<,1>+2,4-D1.0mg/l+IBA0.1mg/l+6-BA0.1mg/l;黑暗条件,愈伤组织增殖培养基为MS<,1>+2,4-D2.0mg/l+6-BA0.3mg/l。光照条件的增殖率要高于黑暗条件,增殖曲线呈“S”型。
5、安宁采野生忽地笑中加兰他敏的含量为0.033%,要高于文山采集的忽地笑,可见地域不同加兰他敏的含量也不同。
6、MS9(NH<,4><+>:NO<,3><->=25:25)增殖的愈伤组织中加兰他敏的含量为0.042%,要远远高于MS<,1>增殖的培养基,也高于野生忽地笑中的含量,因此采用二步培养法是获取高含量加兰他敏细胞系最有利的方法。首先再MS<,1>培养基上增殖获取大量的愈伤组织,然后在MS<,9>培养基上诱导获得高含量的加兰他敏。
7、蔗糖有利于加兰他敏的积累,浓度在40g/l时,加兰他敏的含量最高。