论文部分内容阅读
青霉属真菌能够产生多种次级代谢产物,对于人类疾病治疗和农业发展具有重要影响。同时,很多青霉能够产生木质纤维素降解酶,并被广泛用于工业生产,有力的推动了生物产业的发展。其中,草酸青霉(Penicillium oxalicum)能够产生酶系完全的木质纤维素降解酶,其高产突变菌株已经应用于纤维素酶工业生产多年。但是,高产突变株伴随着产孢能力严重下降,由此带来了工业生产成本的增加。此外,研究发现,草酸青霉中具有28个次级代谢基因簇,具有潜在的生产次级代谢产物的能力。因此,深入了解纤维素酶合成及孢子形成的调控机制及糖苷水解酶合成机制,对草酸青霉的工业应用具有重要意义。我们主要研究内容如下：1.草酸青霉LaeA调控孢子发生及次级代谢LaeA对于草酸青霉孢子合成及次级代谢具有重要的调控作用。在草酸青霉中,laeA缺失后(△laeA)严重影响分生孢子的合成,△laeA中与孢子合成相关的brlA和abaA表达量显著下调,表明LaeA的调控位于这两个基因上游。当在△laeA中过表达brlA能够明显上调brlA, abaA和wetA的表达量,但是仍不能恢复分生孢子的缺陷。 △laeA△creA完全阻断孢子形成,7个与色素合成相关的基因(albA/wA, abrBlyA, arpA, aygA, arpA-like, arpB, arpB-like)和3个孢子壁蛋白基因(rodA, rodA-like和rodB)表达几乎沉默,推测这是双敲菌株产孢障碍的重要原因。同时,△laeA, △creA及△laeAAcreA中细胞壁形成相关基因表达下调,使△laeA和△laeAAcreA对于CR, SDS和CFW的耐受能力明显下降。此外,草酸青霉中28个次级代谢基因簇中,有4个簇在△laeA中表达沉默,其中2个与BrlA缺失株中沉默基因簇重合,表明LaeA参与基因簇沉默部分由BrlA介导。共调控基因簇中6个典型的连续区域位于染色体端粒区附近,表明LaeA调控的基因簇具有朝向端粒区的位置偏好性。沉默基因簇在△laeA△creA菌株中脱阻抑,表明敲除laeA后,CreA的缺失能够修复基因簇的抑制作用,可能是由另一LaeA-like甲基转移酶PDE 03083介导。另外,草酸合成基因PDE 06062在三株突变株中都表达下调,草酸含量测低于野生型,△laeA△creA更是表现出叠加效应,草酸合成最低。酵母双杂交显示,尽管LaeA与CreA并没有直接的相互作用,但是LaeA和CreA的共调控功能对于无性孢子的正常合成及基因簇的表达是必需的。在草酸青霉中,LaeA能够与纤维素酶／半纤维素酶基因的转录激活因子XlnR及染色质重塑因子Swi6相互作用(未发表),推测LaeA被XlnR招募,通过组蛋白修饰及染色质重塑的功能使得染色质开放,激活孢子形成、次级代谢基因簇相关基因的转录。2.草酸青霉LaeA-like蛋白对于纤维素酶基因表达及孢子发生调控初步研究LaeA对于木质纤维素降解酶的合成具有调控作用。氨基酸序列分析显示,以LaeA为代表的草酸青霉第23家族成员(LaeB、LaeC、LaeD、LaeE、LaeF、 LaeG、LaeH。LaeI)都含有SAM结合位点,预测为蛋白甲基转移酶。进化树分析表明第23家族甲基转移酶与LaeA亲缘关系较近,推测它们对于纤维素酶合成及孢子发生的调控或许与LaeA具有相似的调控模式。研究发现,△laeB在单一碳源培养基上,菌体生长较差,菌落褶皱多,孢子计数进一步确认△laeB孢子数量较野生型略低。显微观察发现,△laeB菌丝数量较少,产孢延迟约2 h。LaeB缺失菌株(△laeB)纤维素酶合成显著下调,相反,△laeE、△lael滤纸酶活是野生型的1.5-2倍,RT-PCR验证LaeB在转录水平上对主要纤维素酶基因进行调控。此外,对LaeB、LaeC和LaeD表达谱分析表明,LaeB主要功能与LaeA相似,调控部分次级代谢基因簇表达沉默,但是LaeD却调控大部分基因簇表达上调,与LaeA功能相反。