阪崎克罗诺杆菌菌膜形成相关基因的筛选鉴定

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阪崎克罗诺杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、菌血症、小肠结肠炎,并可能引起神经功能紊乱,造成严重的后遗症,死亡率高达20%-50%,引起世界范围内的广泛关注。通过研究发现婴儿配方奶粉是其主要的感染源。菌膜形成是细菌对抗不利环境的一种自我保护机制。在形成菌膜后,菌体对外界各种理化因子的耐受力会大大增加。在阪崎克罗诺杆菌的菌膜形成中,纤维素合成的相关基因、鞭毛的形成和功能基因均起到了非常重要的作用。然而,目前关于阪崎克罗诺杆菌的菌膜形成机制仍然不清楚。  本研究首先利用结晶紫染色法,对23株食源性阪崎克罗诺杆菌菌膜形成能力进行检测,从中筛选出1株菌膜形成能力最强的菌株。再利用电转化法,将EZ-TN5转座子转入到这株阪崎克罗诺杆菌中,构建了转座子随机突变库,共获得430株突变株。随后利用结晶紫法对430株突变株的菌膜形成能力进行检测,筛选出菌膜形成能力较野生型菌株均降低40%以上的突变株12株。利用IPCR(反向PCR)和Tail-PCR(交错式热不对称PCR)的方法对这12株突变株中EZ-TN5转座子插入位点的侧翼序列进行扩增,最终成功测序出8个目的基因序列,BLAST同源性比对结果显示这8个基因可能编码的蛋白分别为:hypotheticalproteinCTU_14280、aldehydereductase、phosphopentomutase、lipoproteinNlpD、argininosuccinatesynthase、phagetailproteinR(GpR)和excinucleaseABCsubunitA。利用Southern杂交的方法证实了这8个突变株基因组DNA中均只含有一个转座子序列,从而证明这些基因与菌膜形成的相关性。通过对阪崎克罗诺杆菌野生型和菌膜突变株生长曲线的对比分析可知,突变后的菌株生长速率并未明显改变,证明菌膜形成降低并不是由于菌体生长受到抑制造成的。利用扫描电镜对野生株和突变株形成的菌毛进行检测,结果显示野生型可以形成较厚的菌膜,而突变株只能形成一层较弱的胞外聚合物,进一步证实了这些基因与菌膜形成的相关性。
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