圆圈病毒人源1型（Gyrovirus homsa1,GyH1）是无囊膜、呈二十面体对称、小的单链环状DNA病毒,是圆圈病毒属的成员之一。GyH1起初被命名为圆圈病毒3型（Gyrovirus 3,Gy V3）,在2021年更名为圆圈病毒人源1型。GyH1首先在急性腹泻的儿童粪便中发现,随后在市场上售卖的鸡肉、患有传染性病毒性腺胃炎（Transmissible viral proventriculitis,TVP）的肉鸡、野生迁徙鸟类和多种哺乳动物中发现。此外,鸡和小鼠的致病性实验表明GyH1是一种造成再生障碍性贫血、免疫抑制和多系统严重损伤的致病病毒。不仅如此,生殖性试验证实GyH1是传染性病毒性腺胃炎的直接致病因素。TVP可以造成鸡生长不良和发育迟缓,严重影响鸡的生产性能。然而,GyH1感染在鸡群中的流行情况还不清楚。基于此,本研究旨在开发检测GyH1的间接ELISA（Indirect ELISA,i-ELISA）和双抗体夹心ELISA（Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA）以调查GyH1感染在鸡群的流行情况。GyH1包含三个主要的开放阅读框,编码3种主要的病毒蛋白质。VP1是GyH1的主要衣壳蛋白,在病毒组装、复制和感染中起关键作用。VP1可以与骨架蛋白VP2诱导产生中和抗体。本研究分析了VP1基因的抗原性和疏水性并选取抗原性高的区域构建了原核表达载体。此外,本研究优化了VP1蛋白原核表达条件并高效表达了VP1蛋白。同样地,本研究使用SDS-PAGE和Western blot对纯化后的VP1蛋白的进行检测以验证VP1蛋白的纯化效果和免疫原性,结果显示VP1蛋白纯化效果良好且具有较高的免疫原性,可用于后续单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立。为了评估间接ELISA的临床应用价值,本研究采用纯化的VP1蛋白为包被抗原,并逐步优化间接ELISA各个反应条件以达到最佳反应效果。结果显示,使用0.05 M的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释纯化的VP1蛋白至0.9μg/m L,并置于4℃过夜。最佳封闭条件为用含有Tween 20的PBS溶液（PBST）稀释至5%的脱脂乳并在37℃下封闭1 h最佳。鸡抗GyH1阳性血清用PBST以1:640稀释并在37℃下孵育1 h反应效果最佳。最佳羊抗鸡抗体的稀释度为1:5,000,并置于37℃下孵育1 h。最佳显色时间为在37℃下孵育15 min最佳。采用优化的条件,经验证,i-ELISA的临界值为0.184。敏感度和特异性分别为93.4%和98.5%。重复性和稳定性的变异系数小于10%。综合以上结果表明i-ELISA具有高度的敏感度、特异性、重复性和稳定性,可用于GyH1的血清流行病学调查。本研究使用纯化的VP1蛋白与弗氏佐剂融合乳化后免疫小鼠以获得抗GyH1的单克隆抗体。在制备单克隆抗体过程中经过一系列验证及检测,最终从21株杂交瘤细胞中筛选到5株稳定表达且效价高的单克隆抗体。接下来,本研究使用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体并通过棋盘滴定法进行单克隆抗体配对试验,结果显示单克隆抗体2F2和3H1可以稳定结合。本研究逐步优化DAS-ELISA的各个反应条件并建立DASELISA方案。结果显示捕获抗体2F2和检测抗体3H1的最佳浓度分别为3μg/m L和6μg/m L。将抗原用PBS稀释至1:4并在37℃孵育1 h。最佳封闭条件为4%的脱脂乳在37℃下孵育1 h。检测抗体最佳孵育时间为37℃下孵育1 h。最后,确定最佳显色时间为37℃下孵育15 min。DAS-ELISA临界值为0.254,敏感度和特异性分别为93.14%和98.67%,重复性和稳定性变异系数均低于10%。结果表明开发的DAS-ELISA具有高度灵敏性、特异性、稳定性和重复性。为了评估GyH1感染在鸡群中的流行情况,本研究使用开发的间接ELISA对中国13个省份的鸡群进行GyH1的血清流行病学调查。血清流行病学调查结果显示,GyH1的血清阳性率在中国13个省份跨度为0.6%～7.7%,在8个鸡品种的跨度为3.1%～8.1%,本土鸡的血清阳性率显著低于国外品种鸡。同样地,本研究统计了肉种鸡和蛋鸡的血清阳性率,其血清阳性率分别为8.6%和5.3%。此外,本研究观察到鸡在0～30 d、30～60 d、60～180 d和180 d以上的GyH1血清阳性率分别为13.5%、34.4%、8.3%和1%。为了进一步了解GyH1感染在鸡群的流行情况,本研究使用开发的DAS-ELISA对中国15个省份的鸡群进行GyH1的流行病学调查。流行病学调查结果显示GyH1在15个省份的阳性率跨度为3.5%～13.7%,在8个鸡品种的阳性率跨度为4.5%～12.3%。同样地,我们观察到GyH1在肉种鸡和蛋鸡的阳性率分别为12.6%和9.6%。此外,年龄与GyH1的阳性率呈负相关性,鸡在1～14 d、14～35 d、35～98 d、98～189 d和189 d以上的GyH1阳性率分别为14.5%、25.5%、10.8%、8.2%和4.6%。为了揭示GyH1在鸡体内病毒增殖和中和抗体消长规律,本研究联合使用开发的iELISA和DAS-ELISA对感染GyH1的1日龄SPF鸡的不同感染阶段进行动态监控。结果表明,在感染GyH1后,抗GyH1中和抗体在感染后21 d可以在血液检测到,在感染后35 d达到峰值,感染后49 d降至阴性水平。此外,在感染GyH1后14 d出现GyH1病毒血症。病毒滴度在感染后21 d达到峰值,在感染后35 d降至阴性水平。综上所述,本研究构建了VP1基因的原核表达载体并成功表达和纯化了VP1蛋白。基于此,本研究开发了间接ELISA和双抗体夹心ELISA。间接ELISA和双抗体夹心ELISA经测试具有高度的敏感性、特异性、稳定性和重复性,可用于调查GyH1感染的流行情况。血清流行病学和流行病学调查的结果表明自然GyH1感染的在鸡中广泛存在。鸡的不同品种对GyH1感染具有不同的遗传抗病性能。此外,鸡的日龄对GyH1感染表现出不同的易感性,雏鸡更易感染GyH1。此外,本研究揭示了GyH1感染鸡后体内中和抗体的增长和病毒增殖呈负相关。本研究的结果对于GyH1的流行病学提供了有价值的参考。相信我们的研究可以为GyH1的防控做出积极的贡献。