白草花叶病毒P1基因生物学功能的研究及转激活蛋白基因烟草的培育

来源 :中国农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fengsuiyu
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本研究通过将白草花叶病毒P1基因转化本生烟,并利用植物病毒载体PVX将此基因导入本生烟观察症状变化推测P1蛋白的生物学功能。将白草花叶病毒的P1基因连接到中间载体pRT103上,获得重组子pRT103P1,用PstⅠ单酶切后获得带有35S启动子的P1基因,插入到植物表达载体pCAMBIA1301上,获得重组质粒pCAM1301P1,并将该质粒转化到根癌农杆菌LBA4404中,利用叶盘法转化本生烟,获得了具有潮霉素抗性的再生植株。 分子检测结果表明22株中有3株为转P1基因阳性植株。阳性植株与野生型植株相比生长较弱,叶片比野生型的小。因此,白草花叶病毒P1基因对本生烟的生长发育可能有不利影响。转P1基因阳性植株的获得为进一步研究该基因的功能提供了条件。 将白草花叶病毒P1基因插入PVX载体,在体外转录后接种本生烟,观察症状表现。接种PVX空载体作为对照的植株表现轻微系统花叶症状,而接种pPVXP1的本生烟叶片出现斑驳和坏死斑,新生叶片表现畸形,症状明显比对照严重,推测白草花叶病毒P1基因可能参与对PVX的协生作用,增强了PVX的致病性。接种pPVXP1的植株比对照发病延迟,可能是由于白草花叶病毒P1蛋白的表达减缓了PVX病毒粒子的系统运动。 前人的研究表明,从真菌中克隆出的激活蛋白基因产物有抗病毒作用,扩增激活蛋白基因,插入植物双元表达载体pCAMBIA1301,利用农杆菌介导法转化烟草,在含有潮霉素的培养基上筛选抗性植株。在MS培养基上暗培养两天,在MSI上约三周后分化出小芽,转入生根培养基MSⅡ诱导生根。 本实验共获得100多个再生植株,对其中30个再生植株的PCR和RT-PCR检测结果表明29株为阳性,转化率高达96.7%。取转基因阳性植株接种TMV,一周后野生型普通烟及转基因阳性植株都出现花叶,但是与野生型植株相比,转激活蛋白基因的植株褪绿较轻微,一个月后症状加重,但与野生型相比叶片仍然只表现褪绿而不黄化。转激活蛋白基因烟草植株的获得为进一步研究此蛋白的功能奠定了基础,对培育烟草抗病品种也有重要意义。
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