深海细菌Pseudomonas sp.IOFA1的全基因组分析及其甲醛代谢途径关键酶基因的克隆表达

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深海中蕴藏着巨大的生物资源。生境独特多样的深海沉积和洋壳环境蕴育了海底深部生物圈微生物的高度多样性,表现为物种、基因、生理生化和生态功能的多样性。海底深部生物圈已经成为生物技术开发的一个重要领域。   从深海沉积物中筛选到一株可高效降解甲醛的菌株(Pseudomonassp.IOFA1),本文对该菌株进行了全基因组的测序,并对该菌株甲醛降解途径中的关键酶醇脱氢酶,甲醛歧化酶和甲酸脱氢酶展开研究。首先利用第二代高通量测序技术solexa对该菌株进行了全基因组测序以及基因预测与注释。测序结果表明,该菌株的基因组由一个环状的染色体构成,GC含量61.38%,预测所得gene数为5361个,Coding区域的长度4921410。在基因组序列上共找到205个串联重复区域,平均拷贝数为3.75;转座子59个,67个tRNA序列和12个rRNA序列。通过KEGG分析发现了该菌株的甲醛代谢途径。该菌属于甲基营养菌,能够同化甲烷生成甲醇,继而甲醇被氧化为甲醛,甲醛也是多条途径的中间产物。甲醛通过一定途径氧化为甲酸,最终甲酸被氧化为水和CO2。该途径中完整的醇醛酸氧化还原酶系统,包括醇脱氢酶系统、甲醛氧化酶系统以及甲酸脱氢酶系,这些酶都具有很高的应用价值。   醇脱氢酶(AlcoholDehydrogenase,ADH)能够催化醇类脱氢氧化为醛。在菌株测序结果中发现能够编码ADH的ORF。该酶由379个氨基酸残基组成,分子量约为40691Da,由全长为1140bp的adh基因编码。通过对重组ADH酶性质的研究,发现该酶的最适作用温度为42℃左右,在pH为5时具有最高活性,Zn2+的存在对该酶的催化有比较明显的促进作用。   甲醛歧化酶(FormaldehydeDismutase,FDM)将甲醛氧化为甲酸和甲醇。我们在Pseudomonassp.IOFA1的基因注释结果中发现了一个编码甲醛歧化酶的基因fdm。该酶由399个氨基酸残基组成,大小约为42914Da,由全长为1200的fdm基因编码。重组质粒pcold(Ⅱ)-fdm在BL21(PG-Tf)中得到良好的可溶性表达。后期对重组FDM酶性质的初步研究表明,该酶的最适作用温度位23℃左右,pH为7.5时表现出最大酶活性。   甲酸脱氢酶(FormateDehydrogenase,FDH)能够催化甲酸脱氢,氧化为水和CO2,同时伴随着NAD+生成NADH。由于该酶催化的反应只产生一种副产物即CO2,对酶活性没有影响,而且很容易从反应体系中脱离出来,因此甲酸脱氢酶系是一个良好的辅酶再生系统。在Pseudomonassp.IOFA1的全基因组测序结果和基因注释信息中,发现了与编码该酶有关基因fdhβ。该基因全长951bp,编码316个氨基酸,蛋白大小约为34481Da。重组FDH酶的最适作用温度为40℃,在pH6下有最高催化活性,该酶在20-40℃表现出良好的热稳定性。   本文的研究的醇脱氢酶,甲醛歧化酶和甲酸脱氢酶属于菌株甲醛代谢途径中的醇醛酸氧化还原酶系,它们构成了完整的甲醇→甲醛→甲酸→CO2的代谢途径,对该酶系的研究对于我们研究Pseudomonassp.IOFA1的甲醛代谢机制,及其在治理甲醛污染中的应用具有重要的意义。
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