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肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一。目前，HCC的主要治疗方法仍然是外科手术切除，影响术后生存率的关键因素是早期发现、早期诊断、早期治疗。定期对HCC高危人群进行血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）检测和影像学检查是早期发现HCC病人的最佳方法。 本研究利用细胞融合技术建立分泌抗AFP单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）的杂交瘤细胞株，经过系列鉴定，挑选出两株特异性强、亲和力高、针对AFP分子上不同抗原决定簇的McAb 1E6和3A8，分别用于标记纳米级的胶体金颗粒和包被微孔硝酸纤维膜（nitrocellulose membrane，NCM），并结合层析 郑州大学2002年硕士论文 血清甲胎蛋白胶体金免疫层析诀速检测法的建立及其在肝细胞肝癌诊断中的应用技术制备检测血清 AFP的胶体金免疫层析分析＊olloidal goldlmmunocbomatographlc assaX CIA)试纸条，为 HCC高危人群的普查和医院辅助诊断HCC提供特异、灵敏、简便、快速的诊断技术。 方法：1．用纯化的AFP抗原兔疫BALA儿小鼠，取其脾脏 一细胞，在50％聚乙二醇的作用下与小鼠骨髓瘤细胞SP。；。融合。用酶联免疫吸 et分祈法（enzxme－link i。unoso山ent assaX ELISA）检测杂交瘤细胞培养上清，强阳性孔用有限稀释法克隆培养，亘至阳性率达到 100％；扩大培养杂交瘤细胞，部分细胞液氮冻存建立细胞库，部分细胞注射于用石蜡油预处理过的BALA儿小鼠腹腔，制备含McAb的腹水；用竟争抑制法、免疫组化和兔疫印记电泳鉴定McAb的特异性；用ELISA法测定亲和力常数；用ELISA法测定免疫球蛋白的类型及亚型。 2．用拘椽酸三钠还原法还原氯金酸制备亘径为25纳米的胶体金颗粒并标记 MCAb E。，用玻璃纤维吸附标记物并冷冻干燥。 3．用 0刀IM pH7．2的 PBS缓冲液将纯化的 MCAb 3As和兔抗鼠免疫球蛋白抗体分别稀释至 Zing／ml和 4mg／ml，用包被机在NCM上划两条相距4mm的线，将两种抗体固定到NCM上，以捕捉样品中的 AFP抗原和胶体金标记的 MCAb E卜 2 郑州大学2002年硕土论文 血清甲胎蛋白胶体金免疫层析快速检测法的建立及其在肝细胞肝癌诊断中的应用 4．将PVC塑料板、含冻干胶体金标记MCAb的玻璃纤维。 包被有McAb和多克隆抗鼠兔疫球蛋白抗体的NCM、吸水材料 等组装并切割成3turn宽、约80mm长的试纸条。 5．将试纸条分别放置于 37℃和 4oC保存，定期抽查，观察不。同保存温度对检测试纸条质量的影响。 6．将检测过的试纸条室温晾干后密封放置于4℃保存，观察检 测结果的保存期。 7．用该试纸条检测卫生部药品生物制品检定所提供的AFP 系列标准品，确定该检测试纸条的最小检出值。 8用试纸条检测系列稀释的高浓度AFP样品，以确定试纸条 检测AFP的线性范围。 9．用ELISA试剂盒和本法建立的CIA试纸条分别检测经放射 兔疫分祈法仁adioinunnoassap RIA)证实AFP阴性和阳性的血清 标本 147份叩性 72份，阴性 75份人以比较mA试纸条与 RIA 和 ELISA的阴性符合率、阳性符合率和总符合率，并用四格表的 X‘检验推断 CIA与 MA、CIA与 ELISA的检测结果有无统计学 意义。 结果：l川CAb g亚类：3As为鼠 Ig G1，IE。为鼠 IgG。。，其 轻链均为k“un“。 3 郑州大学2002年硕士论文 血清甲胎蛋白胶体金免疫层析快速检测法的建立及其在肝细胞肝癌诊断中的应用 2．亲和力常数：3 As为 2．7 XIO叫M，IE。为 1．IXIO’M 3．特异性：高 AFP值的病人血清能够抑制 3A币 IE。与 AFP包被载体的结合，而正常人血清不能抑制 3A对 IEs与 AFP包被载体的结合；兔疫组化显示两株MCAb均能与肝癌细胞的胞浆和胞膜结合；免疫印记电泳显示两株MCAb均只与分子量约为70KD的抗原结合；说明这两株MCAb确实是抗AFP的抗体。 4．本检测试纸条加待测标本后 15min判断结果，卫生部标准品 ong／ml、sng／ml门／ml的标准品不能被测出，即为阴性结果；20ng／ml的标准品显示极弱的阳性结果；50ng／ml、100urn／ml、200ng／ml． 400ng／ml的标准品显示由弱到强的阳性结果，其检测线颜色由浅到深。 5．检测 AFP的线性范围为 20ng／ml～1280ng／ml。