论文部分内容阅读
L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)作为泛酸合成途径中的重要调控酶,可以特异性催化L-天冬氨酸脱掉α羧基,生成具有高价值的β-丙氨酸,由L-天冬氨酸生物法生产β-丙氨酸极具工业化潜能。目前对PanD的研究存在着PanD重组酶基因来源有限、自剪切机制不清晰等问题,此外已发现的PanD普遍存在底物依赖性失活现象,限制了其工业化应用。本文选择不同来源的panD基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达,并考察了纯化后的PanD的自剪切情况、酶学性质以及底物失活速率。选择NCBI panD基因库中42种尚未有研究报道的panD基因和2种已发现具有酶制剂开发潜力的panD基因(谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis),按照E.coli的密码子偏好性优化后,连接到pET28a(+)载体上,然后在E.coli BL21(DE3)中重组表达,构建了44株重组菌。利用亲和层析纯化获得相应的重组酶并比较其活力,发现有6种PanD与C.glutamicum PanD、B.subtilis PanD一样具有较高的比酶活。不同来源panD基因转录翻译后自剪切情况可以分为几乎未裂解、部分裂解和基本完全裂解三类。自剪切程度直接影响到酶的活力,孵育可以促进酶裂解成熟,但对酶活的提高并不显著。氨基酸序列亲缘性越近,其自剪切情况也基本相似。研究表明底物L-天冬氨酸对Pan D具有抑制作用,底物浓度越高,抑制作用越强。在底物浓度固定的情况下,剩余酶活与时间呈一级反应关系。测定重组酶的失活速率发现,通常情况下,重组酶的酶活越高,底物失活速率越大。其中杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)来源的PanD的比酶活可达11.8 U·mg-1,是目前报道的最高水平;单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)来源的PanD不仅酶活较高(8.9 U·mg-1),而且底物失活速率较小,为2.071×10-3 min-1,故对这两种来源的重组酶的酶学性质、底物转化能力进行了比较分析。PanDL.m、PanDC.j的最适反应温度均为60℃,最适pH分别为7.0和6.0,它们都在30-50℃,酸性条件下较稳定。相同条件下,与100 g·L-1底物L-天冬氨酸反应24 h,PanDL.m和PanDC.j对底物的转化率分别可到达67.7%和82.2%。