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CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）系统是细菌对噬菌体的长期抗争过程中进化产生的一种获得性免疫防御系统，普遍存在于细菌与古生菌中。CRISPR系统由重复序列(CRISPR array)和重复序列上游的Cas蛋白家族操纵子构成。外来序列经识别并插入到重复序列之间作为间隔序列(protospacers)，这样CRISPR系统就具有了识别外侵DNA的能力。根据参与组分不同，CRISPR系统可以分为三种类型，分别为I型、II型和III型。其中II型CRISPR系统参与组分最为简单，最新的基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统即基于II型开发而来。与锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN)技术和转录激活因子样效应子核酸酶(Transcriptionactivator-like effector nucleases, TALEN）技术这两种相对成熟的基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统在操作上更灵活便捷，大大缩减了构建动物或细胞模型所需的时间和资金。人类UHRF1(ubiquitin-like with PHD and RING finger domains1)蛋白是由UHRF1基因表达的一类多功能结构域蛋白，参与多种生物学过程，包括基因调控、甲基化遗传、细胞周期进程以及肿瘤发生等，但目前对其作用的精确机制并不完全清楚，因此建立UHRF1基因敲除人类细胞模型对更细致地研究UHRF1蛋白的功能有非常重要的意义。研究目的：应用基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统，在人胚肾上皮细胞系（HEK293T）中尝试建立UHRF1基因特异敲除的人单克隆细胞株，并初步分析UHRF1基因敲除对HEK293T细胞生命进程的影响。研究方法：①设计靶向UHRF1基因外显子区域的gRNA序列，克隆至gRNA载体。将克隆获得的gRNA载体与hCas9载体共转染人胚肾上皮细胞（HEK293T），经嘌呤霉素（puromycin）及有限稀释法对细胞进行筛选后，建立多个单克隆细胞株；②通过测序以及Western blot方法进行目的蛋白表达验证，获得UHRF1基因敲除的单克隆细胞株；③用LUMA实验验证UHRF1蛋白敲除引起的HEK293T细胞基因组整体甲基化水平变化；④用流式细胞技术检测UHRF1蛋白低表达对HEK293T细胞周期以及细胞凋亡的影响。实验结果：成功筛选获得UHRF1基因特异性靶位点并构建gRNA载体，与hCas9载体共转染HEK293T细胞后建立34个单克隆细胞株；经Western blot鉴定，获得三株UHRF1蛋白低表达HEK293T细胞株，靶位点测序证实均为UHRF1杂合子（UHRF1+/-）细胞株；选取一株UHRF1蛋白表达量最低HEK293T细胞株经LUMA实验证实，该细胞基因组DNA呈低甲基化状态，且UHRF1蛋白恢复表达可恢复该基因组的甲基化水平；流式细胞技术检测结果显示，UHRF1蛋白低表达可延长HEK293T细胞G1期并使细胞凋亡率显著增加。结论：本研究应用CRISPR/Cas9系统，首次在HEK293T细胞中对UHRF1基因进行特异性敲除，建立UHRF1蛋白低表达人单克隆细胞株，且该细胞株基因组整体甲基化水平降低。进一步实验表明，UHRF1基因敲除引起HEK293T细胞周期变化及高凋亡率，实验结果不仅为深入研究UHRF1参与细胞表观调控的作用机制提供有效的人类细胞模型，而且对基于UHRF1基因/蛋白的肿瘤诊断与新药研发也具有潜在的参考应用价值。