2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）是环境和遗传因素共同作用导致的复杂性疾病,人体肠道菌群作为一种机体内环境因素,受到重金属、农药、颗粒物等多种外环境暴露的影响,在PM2.5、砷和镉等环境因素引发机体胰岛素抵抗或DM相关代谢物改变过程中发挥着关键的介导作用,其相关研究对阐明环境因素致T2DM及其并发症发生发展的作用机制具有重要作用。血管并发症是T2DM致死的主要原因,其中糖尿病冠心病（Diabetes patients with coronary heart disease,DM＿CHD）和糖尿病周围神经病变（Diabetic peripheral neuropathy,DPN）是常见的大血管和微血管并发症,但其发病机制尚未完全阐明。目前T2DM、血管并发症和健康人群间菌群多样性改变、差异菌群和代谢物种类在不同人群研究中存在不一致结果,菌群和代谢物与血管并发症间的关联也存在差异。同时,既往研究大多仅采用单一组学技术进行肠道菌群或血浆代谢物的研究,很少对T2DM的单一并发症进行研究,结果易受共存并发症干扰。另外,宏基因组鸟枪法测序技术可以系统分析菌群种属和功能差异。然而,目前采用宏基因组鸟枪法测序技术进行DM＿CHD和DPN的肠道菌群分析,特别是同时结合代谢组学进行病因和机制探索的研究未见报道。因此,本研究采用病例对照研究设计,结合宏基因组和代谢组学技术探索T2DM血管并发症（DM＿CHD、DPN）人群肠道菌群结构、代谢物水平和相关功能,揭示肠道菌群及代谢物与T2DM血管并发症发生发展的关联,为进一步研究T2DM心血管并发症的发病机制和个性化防治提供科学依据。本研究具体从以下三个部分开展研究工作:第一部分2型糖尿病血管并发症人群肠道菌群结构及功能通路目的:探究DM＿CHD和DPN人群粪便肠道菌群多样性、结构和功能通路特征,为T2DM血管并发症的发病机制关联研究提供科学依据。方法:选取2015-2016年在湖北十堰市两所医院53例T2DM病例作为发现人群,其中T2DM无并发症组20例、DM＿CHD组13例、DPN组20例。验证人群在相同医院收集,共纳入84例T2DM病例,其中T2DM无并发症组30例、DM＿CHD组24例、DPN组30例。另外分别选取20例和49例非DM人群作为发现和验证人群的对照进行进一步对比分析。对所有研究对象进行统一的问卷调查、体格检查和血液、粪便样本收集,按标准方法完成血样临床指标检测,粪便样本使用Illumina平台Novaseq 6000进行宏基因组鸟枪法检测,数据经过质控过滤后进行物种和功能注释,使用Mann-Whitney检验和多响应置换过程分析比较组间物种多样性、物种和功能基因相对丰度的差异,采用多元Logistic回归模型分别计算显著改变的肠道菌群与DM＿CHD和DPN的患病风险比值比和95%置信区间。结果:发现和验证人群DM＿CHD和DPN组属、种水平Alpha多样性指标组间比较无显著差异（P均＞0.05）。在属、种水平,结合物种丰度比较和患病风险分析的结果,DM＿CHD组产丁酸盐菌群平均相对丰度在发现和验证人群中均显著降低（P均＜0.05）。调整年龄、性别和体质指数后,这些产丁酸盐菌群会降低DM＿CHD患病风险（OR均＜1,P均＜0.05）。其中发现人群产丁酸盐菌群Dysosmobacter菌属（P=0.041）、Dysosmobacter welbionis菌种（P=0.044）、Lachnospira菌属（P=0.039）和Lachnospira eligens菌种（P=0.038）降低最明显。验证人群结果与发现人群类似（FDR均＜0.05）。DPN组菌群改变及患病风险分析结果与DM＿CHD组类似,具体表现为产丁酸盐菌群卟啉单胞菌（Phocaeicola salanitronis）菌种（P＜0.001）、双歧杆菌（Bifidobacterium）菌属（P=0.019）、角形双歧杆菌（Bifidobacterium angulatum）菌种（P=0.030）和普雷沃氏菌属（P=0.032）均显著降低。验证人群也发现类似结果（FDR均＜0.05）。此外,与DPN组相比,产丁酸盐菌群在DM＿CHD组丰度降低更为明显,尤其是Dysosmobacter菌属（P=0.042）和Dysosmobacter welbionis菌种（P=0.045）。菌群功能基因分析发现两组胰岛素抵抗、甘油酯代谢、赖氨酸、苯丙氨酸等生物合成功能基因显著上调,精氨酸、丙酸代谢、叶酸合成功能基因显著下调（P均＜0.05）。结论:DM＿CHD和DPN人群肠道菌群多样性无显著变化,但菌群结构和功能通路均存在明显改变。菌群改变主要表现为产丁酸盐菌群和普雷沃氏菌丰度均显著降低,且DM＿CHD人群菌群改变更为明显。这些菌群改变可能通过促进芳香族氨基酸和肽聚糖生物合成,抑制碳水化合物和维生素代谢,进而增加T2DM血管并发症人群的患病风险。第二部分2型糖尿病血管并发症人群相关代谢物特征和代谢通路目的:通过非靶向和靶向代谢组学检测揭示DM＿CHD和DPN人群代谢物和代谢通路特征,为T2DM血管并发症病因及发病机制提供科学依据。方法:第一阶段选取2015-2016年在湖北十堰市两所医院T2DM病例84例作为发现人群,其中T2DM无并发症组30例、DM＿CHD组24例、DPN组30例,分别进行粪便和血浆样本非靶向代谢组学检测;第二阶段针对非靶向代谢组结果中主要的组间差异代谢物类别进行靶向代谢组学检测,研究人群与第一部分发现人群保持一致。数据经过质控后,采用t检验、差异倍数和偏最小二乘判别及校正的偏最小二乘判别分析进行组间差异代谢物的筛选和比较,采用多元Logistic回归模型分别计算显著改变的粪便和血浆代谢物与DM＿CHD和DPN的患病风险比值比和95%置信区间。结果:结合单、多变量差异代谢物筛选结果及患病风险分析,非靶向和靶向代谢组结果均显示与T2DM无并发症相比,DM＿CHD组血浆组氨酸(P非靶向=0.013,P靶向=0.004)和精氨酸(P非靶向=0.010,P靶向=0.015)水平显著降低。与非DM组相比,DM＿CHD组除血浆组氨酸（P＜0.001）和精氨酸（P=0.001）水平显著降低外,粪便和血浆中熊脱氧胆酸（P粪=0.039,P血=0.009）和β-熊脱氧胆酸（P粪=0.025,P血=0.021）水平均显著升高（FDR均＜0.05）。调整年龄、性别和BMI后,组氨酸（OR=0.973,P=0.023）和精氨酸（OR=0.856,P=0.037）均可降低DM＿CHD人群的患病风险。与T2DM无并发症组相比,DPN组粪便中牛磺胆酸(P非靶向=0.007,P靶向=0.030)和血浆中精氨酸(P非靶向=0.015,P靶向＜0.001)、甘氨酸(P非靶向=0.026,P靶向＜0.001)和赖氨酸(P非靶向=0.034,P靶向＜0.001)水平在两个检测人群均显著升高,但仅发现赖氨酸可显著增加DPN人群的患病风险（OR=1.092,P=0.017）。与非DM组相比,粪便中十八烷二酸（P=0.023）及血浆中脱氧胆酸（P=0.007）、熊脱氧胆酸（P=0.020）和组氨酸、精氨酸等6种氨基酸水平在DPN组中显著升高,而血浆中壬二酸和顺-5-十四烯酸等5种游离脂肪酸水平均显著降低（P均＜0.05,FDR均＜0.05）。同时DM＿CHD人群中血浆代谢物水平显著降低的组氨酸(P非靶向=0.021,P靶向＜0.001)和精氨酸(P非靶向=0.034,P靶向＜0.001)在DPN组中显著升高（FDR均＜0.05）。代谢通路分析显示两组人群粪便和血浆代谢物通路富集因子最高的均是血管内皮生长因子信号通路（最大富集因子=0.176,P=0.054）和精氨酸生物合成通路（最大富集因子=0.429,P=0.031）。结论:DM＿CHD和DPN人群粪便和血浆代谢物水平及代谢通路均存在明显改变,且血浆代谢物改变更为明显。DM＿CHD人群粪便和血浆中β-熊脱氧胆酸、熊脱氧胆酸水平均显著升高,而血浆中组氨酸和精氨酸水平均显著降低。DPN人群粪便中牛磺胆酸和血浆中精氨酸、赖氨酸水平均显著升高,而血浆中壬二酸等游离脂肪酸水平均显著降低。与DM＿CHD人群相比,DPN人群粪便石胆酸及血浆组氨酸和精氨酸水平更高。这些改变的代谢物可能通过影响血管内皮生长因子信号通路和精氨酸生物合成等通路增加T2DM血管并发症人群的患病风险。第三部分2型糖尿病血管并发症人群肠道菌群及代谢物关联分析目的:整合宏基因组和代谢组进行关联分析并筛选区分和识别T2DM血管并发症的特征性肠道菌群与代谢物,探讨肠道菌群与代谢物在T2DM血管并发症中可能的关联机制。方法:基于第一部分发现人群的宏基因组和相同人群靶向代谢组学数据进行肠道菌群及代谢物关联分析,采用Spearman相关分析按不同分组分别进行粪便及血浆样本的肠道菌群—菌群功能通路—代谢物—临床表型多组学关联分析,构建随机森林模型对各组进行分类,绘制预测模型指标重要性点图,并用受试者工作特征（Receiver operating characteristic curve,ROC）曲线对预测模型进行效能评估。结果:与非DM组相比,DM＿CHD组显著降低的产丁酸盐菌Lachnospira和Leuconostoc菌属与该组显著降低的菌群功能通路和血浆中显著升高的营养胆酸呈显著负相关,同时与糖尿病病程呈显著正相关（|r|最大为0.602,|r|最小为0.364,P均＜0.05）。与T2DM无并发症相比,DPN组显著降低的双歧杆菌属与该组显著降低的菌群功能通路呈显著正相关,同时与该组显著升高的粪便中牛磺石胆酸和血浆中丙氨酸甘氨酸和瓜氨酸呈显著负相关,进一步与血糖、糖尿病病程等临床指标呈显著正相关（|r|最大为0.586,|r|最小为0.329,P均＜0.05）。与非DM组相比,同样发现DPN组显著改变的普雷沃氏菌、梭状芽胞杆菌等菌属与该组显著改变的菌群功能通路及吲哚乙酸、组氨酸和精氨酸等代谢物呈显著正相关,同时与血糖、糖尿病病程等临床指标呈显著相关性（|r|最大为0.709,|r|最小为0.324,P均＜0.05）。与非DM组进行区分时,粪便样本DM＿CHD和DPN组分别在用9个（4个肠道菌属和5个代谢物）和16个（12个肠道菌属和4个代谢物）判别特征预测和识别的准确性最高,准确性分别为68.9%和70.3%,ROC曲线下面积分别为0.751和0.797,各组影响最大的判别特征分别是β-熊脱氧胆酸和Duncaniella菌属;血浆样本DM＿CHD和DPN组分别在用15个（5个肠道菌属和10个代谢物）和33个（12个肠道菌属和21个代谢物）判别特征预测和识别的准确性最高,准确性分别达到76.7%和95.0%。ROC曲线下面积分别为0.905和0.989,各组影响最大的判别特征分别是组氨酸和精氨酸。结论:DM＿CHD和DPN人群特征性改变的肠道菌群可能通过肽聚糖生物合成、胰岛素抵抗、甘油酯代谢等功能通路影响粪便石胆酸及血浆组氨酸、营养胆酸等代谢物水平,从而直接或间接影响人群的血糖水平和T2DM病程等临床表型。此外,特异性肠道菌群（产丁酸盐菌）和血浆代谢物（组氨酸、精氨酸等）对区分T2DM血管并发症人群具有更高的识别预测价值。全文结论:1.T2DM血管并发症DM＿CHD和DPN人群菌群结构和功能通路均存在明显改变。菌群改变主要表现为产丁酸盐菌群和普雷沃氏菌丰度均显著降低。2.T2DM血管并发症DM＿CHD和DPN人群粪便和血浆代谢物水平及代谢通路均存在明显改变,且血浆代谢物改变更为明显。代谢物改变主要表现为DPN人群粪便石胆酸及血浆组氨酸和精氨酸水平显著升高,而DM＿CHD人群正好相反。3.T2DM血管并发症DM＿CHD和DPN人群特征性改变的肠道菌群可能通过菌群功能通路影响粪便石胆酸及血浆组氨酸、营养胆酸等代谢物水平,从而影响人群的血糖等临床表型,进而参与T2DM血管并发症的发生发展。