基于rRNA、gyrB、rpo基因的螺旋藻、节旋藻系统发育研究

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螺旋藻、节旋藻广泛分布于热带、亚热带的淡水湖泊、盐碱地、湿地和河流中。由于其体内富含蛋白质、矿物质、维生素、不饱和脂肪酸等多种生物活性物质,且生长速度快、生物量大,已被广泛应用于食品、医药保健品、化妆品、能源及环境治理领域,成为全球最具开发利用价值的经济微藻之一。但是关于螺旋藻、节旋藻的分类一直以来都存在问题,目前大规模养殖并广泛应用于商业活动的“螺旋藻”实际均为节旋藻。因此为了获得有效的分类靶基因,澄清当前分类的混乱局面,本论文在收集、分离纯化藻株的基础上,采用16S rRNA基因、ITS区、rpoB基因、rpoC1基因、rpoD基因、gyrB基因和sigF基因进行系统发育分析,主要结果如下:  (1)对渤海海滨湿地及周边水域的螺旋藻、节旋藻资源进行调查,发现不同来源水样中螺旋藻、节旋藻的丰度、形态及大小存在明显差异,且不同程度地与其它藻类共存;当水体pH值、总磷含量、总氮含量分别在8.76~9.00、0.11~0.50mg/L和5.1~10.0mg/L时,较适合螺旋藻、节旋藻的生长;通过对部分富集水样的观察镜检,本人分离获得19株纯种藻株,其他同学获得15株纯种藻株。  (2)收集国内外现有的螺旋藻、节旋藻藻株并进行镜检,对于形态存在显著差异的样品进一步挑取单藻丝进行纯化,其中惠赠及购买样品中获得29株纯种藻株,实验室原有样品中获得21株纯种藻株,富集水样中分离纯化获得34株纯种藻株。本次实验藻株共84株,其形态包括直线型(23株)、曲线型(4株)、典型螺旋型(51株)以及高度螺旋型(6株)四种。  (3)对液氮研磨法、反复冻融法、反复冻融-溶菌酶法、溶菌酶法、超声波法、超声波-溶菌酶法等常用细胞壁破碎方法进行了比较及评价,发现六种方法均能在一定程度上破碎节旋藻细胞壁,且处理后提取的基因组DNA能满足基本的生物学实验要求;统计分析表明反复冻融法、溶菌酶法及反复冻融-溶菌酶法破壁后所获得的DNA浓度(>2000 ng/μL)显著高于其它方法,液氮研磨法的最低(<40ng/μL);超声波法所得DNA的OD260/OD280的值大于2.00,其余方法的均在1.90到2.05之间,纯度较高;经PCR扩增16S rRNA基因及ITS区后均得到了单一的目的片段。综合考虑,反复冻融法、溶菌酶法是节旋藻DNA提取时优先考虑的方法。  (4)对克隆的7个基因进行了序列测定和分析,发现基于16S rRNA基因、ITS区、rpoC1基因序列构建的NJ树可将实验藻株分为三个类群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类群),Ⅰ、Ⅱ类群群内藻株之间的序列相似度分别为98~100%,90~94%,92~95%,远远高于Ⅰ、Ⅱ类群与Ⅲ类群的序列相似度91~92%,60~65%,75~78%,故合并为两个大类,支持了该类生物分为两个属的结论,80株实验藻株归为节旋藻,4株归为螺旋藻;rpoB和rpoD基因虽将实验藻株划分为两个类群(Ⅰ、Ⅱ类群),但类群之间的相似度94~96%、95~98%远高于外类群不同属间的序列相似度62~68%、73%,说明这两个基因不能作为螺旋藻、节旋藻在属及其以下水平的分类标记;部分藻株的gyrB基因、sigF基因无扩增产物,但根据已有藻株的聚类结果,推测gyrB基因与16S rRNA基因、ITS区、rpoC1基因的聚类结果类似,而sigF基因则与rpoB基因和rpoD基因的聚类结果相类似。
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