棉铃虫中肠特异性结合蛋白ABCC1对Cry2Ab、Cry1Ac毒力的影响

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昆虫中肠BBMV上的特异性受体蛋白与Bt蛋白结合是Bt发挥杀虫作用的关键,而且特异性受体蛋白发生基因突变或表达量显著改变都可能会使昆虫对Bt产生抗性。已有研究结果表明ABC转运蛋白家族不仅是Cry1A类蛋白的受体,而且ABC转运蛋白的突变与害虫对Bt产生抗性相关。本文在获得了棉铃虫ABCC1基因全长的基础上,对ABCC1在棉铃虫不同组织、不同龄期中的表达量、ABCC1与Cry2Ab、Cry1Ac在体外结合特性及ABCC1对Cry2Ab、Cry1Ac毒力的影响等进行了研究。研究结果可为明确棉铃虫ABCC1蛋白在Cry2Ab、Cry1Ac杀虫机制中的作用、为合理应用Cry2Ab、Cry1Ac用于棉铃虫的防治及延缓棉铃虫抗性发展提供理论依据。主要研究结果如下:  1.利用PCR结合RACE-PCR克隆了棉铃虫ABCC1基因全长,并进行了生物信息学分析。ABCC1基因开放阅读框共4545bp,基因登录号:GenBank KY796050。共编码1515个氨基酸,预测蛋白质的相对分子量169.75kDa,等电点6.68;N末端不存在信号肽;有两个较大的膜外区域,有14个跨膜结构;含两个跨膜结构域和两个核苷酸结构域;有14个较分散的N-糖基化位点,有16个较集中的O-糖基化位点。系统进化树系显示不同鳞翅目昆虫ABCC1-3基因具有密切的亲缘关系,棉铃虫ABCC1与斜纹夜蛾、脐橙螟、玉带凤蝶、柑橘凤蝶的ABCC1基因亲缘关系最接近。  2.ABCC1基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达,在四龄、五龄幼虫中表达量最高,在成虫中最低;在不同组织中均有表达,在马氏管中表达量最高,在前肠中表达量最低。  3.构建原核表达载体在大肠杆菌中表达ABCC1两个跨膜结构域蛋白并纯化,通过蛋白质谱验证表达正确;Ligand blot实验结果表明ABCC1两个跨膜结构域均能与Cry2Ab、Cry1Ac蛋白在体外结合。  4.棉铃虫ABCC1被干扰48h后,ABCC1基因表达量显著降低;注射siABCC1的棉铃虫与不注射、注射DEPC水和siEGFP的棉铃虫相比,用Cry2Ab、Cry1Ac蛋白处理后,幼虫死亡率显著下降。构建PAC-ABCC1重组质粒并转入Sf9细胞系中,通过PCR检测转染成功;导入PAC-ABCC1重组质粒的Sf9细胞较转入PAC空质粒的Sf9细胞对Cry2Ab、Cry1Ac蛋白的敏感性显著升高。  5.比较敏感棉铃虫品系(96S)和Cry1Ac-抗性棉铃虫品系(BtR)ABCC1基因序列,发现ABCC1基因在抗性及敏感棉铃虫中编码区氨基酸序列没有差异;但与敏感品系棉铃虫相比,抗性品系中ABCC1的表达量显著降低,敏感品系棉铃虫ABCC1的表达量约是抗性品系的2.5倍。
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