论文部分内容阅读
猪是人异种器官移植的理想供体,由α-1,3半乳糖苷(α-1,3Gal)引起的猪到人器官移植的超急性排斥反应已经基本解决,但是随之而来的细胞性排斥反应以及血栓和炎症成为目前亟待解决的问题,猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)是引起异种移植细胞性免疫排斥的主要因素之一,转人内皮蛋白C受体(endothelial cell protein C receptor,EPCR)可以有效降低猪到人器官移植引起的血栓和炎症。本研究主要探讨了α-1,3半乳糖苷转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因敲除巴马小型猪(Bama minipig,BMP)的健康水平以及SLA等位基因和单倍型为异种器官移植研究筛选细胞排斥低的供体,制备可以降低异种器官移植引起的炎症和血栓反应的转hEPCR基因猪。本论文共有三部分研究内容,分别为:1.GGTA1基因敲除巴马小型猪的繁育及健康水平检测。本课题组制备的GGTA1基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)巴马小型猪已经繁育到F3代。本研究跟踪了GTKO巴马小型猪的遗传、窝产仔数和血常规血生化指标,评估其繁殖和健康状况。通过PCR产物测序鉴定仔猪GGTA1基因敲除类型,FITC-GSIB4与仔猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)孵育后流式细胞术检测α-1,3-Gal表达,以窝产仔数测定繁殖力,以血常规和血生化检测反映健康状况。结果显示,GGTA1基因的遗传符合孟德尔分离定律;GGTA1敲除纯合子(GGTA1-/-)仔猪的流式检测荧光强度低;GTKO巴马猪母猪头胎窝产仔数为7.38±1.64头,经产母猪窝产仔数为9.43±1.68头,与已有报道的普通巴马小型猪繁殖力无明显差异;血常规血生化检测的各项指标与普通巴马猪基本无差异。总之,连续3代GTKO巴马仔猪遗传稳定,繁殖力正常,生理健康。GTKO巴马小型猪可作为异种器官移植研究的可靠供体。2.GGTA1基因敲除巴马小型猪SLA单倍型分型。本研究主要对SLA基因上5个位点(SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-DRB1和SLA-DQB1)进行研究。采用转录本PCR产物直接测序的方法获得GTKO巴马小型猪SLA等位基因和单倍型,补体依赖的淋巴细胞毒试验(Complementdependent cytotoxicity,CDC)检测不同SLA单倍型猪的PBMC与人血清反应的细胞死亡率。结果发现,GGTA1基因敲除巴马小型猪群的5个SLA位点共发现15个等位基因,其中SLA-2*05:07(序列号:KX022946)和SLA-3*03:10(序列号:KX022947)2条序列为新发现序列,GGTA1基因敲除巴马小型猪群共有5个SLA单倍型,分别为Hp-80.27、Hp-81.27、Hp-83a.45、Hp-82.44和Hp-83b.10c。4种杂合单倍型(Hp-80.27/81.27,Hp-82.44/83b.10c,Hp-80.27/83b.10c和Hp-83a.45/83b.10c)猪CDC结果细胞死亡率都小于27.5%,Hp-80.27/81.27和Hp-82.44/83b.10c单倍型的猪CDC结果细胞死亡率都小于17%。结果表明,不同SLA单倍型猪PBMC与人血清CDC试验结果不同,Hp-80.27/81.27和Hp-82.44/83b.10c单倍型的猪CDC结果细胞死亡率更低,更适合做异种器官移植研究供体。3.转hEPCR基因猪的制备。本研究构建广泛性表达启动子CAG调控的hEPCR基因表达载体pCAGGS-hEPCR-Puro,转染巴马五指山杂交猪胎儿成纤维细胞,通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪。利用PCR技术对克隆仔猪进行转基因鉴定,同时通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western Blot及免疫组化方法分析hEPCR在转基因猪的各个器官中的表达。本研究成功构建了pCAGGS-hEPCR-Puro载体,转染细胞后筛选出71个有效克隆点,共得到2头转hEPCR阳性仔猪,qRT-PCR检测发现hEPCR基因在克隆仔猪肝脏、肾脏、心脏、脾脏、胰脏、肺脏、主动脉等主要器官都有表达,在主动脉、胰脏、肺脏中的表达水平较高。Western Blot和免疫组化结果表明hEPCR蛋白在耳朵、主动脉,胰脏、心脏和肾脏都有表达。本研究成功制备了转hEPCR基因猪,并且hEPCR基因在克隆猪的主要器官组织都有较高的表达水平,为异种器官移植研究制备了良好供体。