论文部分内容阅读
为发掘影响禽类早期快速生长的关键基因,本研究通过对缓慢生长的藏鸡和快速生长的白羽肉鸡垂体组织RNA表达谱进行测序及比较分析,筛选与生长发育相关的候选基因,并对筛选到的候选基因做进一步研究。以42日龄雌性藏鸡与白羽肉鸡为研究对象,每个品种的鸡选取3个重复样本,采用RNA-seq技术和生物信息学方法测定藏鸡和白羽肉鸡垂体组织RNA表达谱,对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)分析、KEGG分析,筛选影响早期生长发育相关的候选基因,之后利用Western blot对候选基因对应蛋白进行亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR技术构建相关候选基因的组织表达谱和时序表达谱。结果显示:1.42日龄雌性藏鸡和白羽肉鸡垂体组织RNA表达谱测序结果各转录本Q30均在90%以上,转录本文库质量好。各转录本中预测到的新转录本长度均在700 bp以上,其中最长的含有30个外显子,最短的仅含有1个外显子。两个品种鸡的可变剪切体均以IR(内含子保留)剪切体模型所占比列高(≈50%)。各转录本SNP中转换型(A-G/C-T)SNP位点分布占76%,颠换型(A-C/A-T/C-G/G-T)SNP位点占24%。2.藏鸡和白羽肉鸡垂体组织RNA表达谱GO、KEGG分析结果分析发现藏鸡与白羽肉鸡垂体组织RNA表达谱有151个显著差异表达的基因,其中包括77个上调基因,74个下调基因(藏鸡Vs白羽肉鸡)。对差异表达的基因及基因产物属性进行注释(GO注释),发现在细胞组分中22个基因得到注释,对应48个功能亚分类;分子功能中20个基因得到注释,对应48个功能亚分类;生物过程中23个基因得到注释,对应242个功能亚分类。对差异表达基因参与的主要代谢途径和信号转导途径进行注释(KEGG注释),结果发现151个显著差异表达基因中有138个被富集到147条KEGG通路中,包括脂代谢、能量代谢、碳水化合物代谢、细胞生长死亡、信号传导等重要代谢通路和信号通路。3.发育过程条目(GO:0032502)富集结果在发育过程条目(GO:0032502)上共富集到9个显著差异表达基因,其中5个上调基因(FST、GH、LHFPL5、BPIFB7、NPY)和4个下调基因(PTHLH、EGR1、IGF2BP1、SHH)(藏鸡Vs肉鸡)。分析显示EGR1、IGF2BP1、SHH基因的下调是导致藏鸡早期生长缓慢的重要因素。4.表达谱qPCR验证结果在差异表达基因中随机挑选8个基因(EGR1、FST、FKBP5、GH、LOC419390、PPARG、ZBTB16、SHH),利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术对表达谱进行验证,qPCR结果与转录结果一致,说明该表达谱数据可靠。5.FST及EGR1蛋白亚细胞定位结果利用Western blot技术对FST及EGR1蛋白进行亚细胞定位,结果显示FST在藏鸡和白羽肉鸡垂体、下丘脑、胸肌和腿肌组织细胞中主要定位于细胞质中;而EGR1蛋白则主要定位于细胞核内。6.FST和EGR1基因组织表达谱构建结果FST和EGR1在藏鸡和白羽肉鸡各个日龄阶段均在垂体组织中表达量最高,极显著高于其他(下丘脑、胸肌和腿肌组织)组织(P<0.01)。1~42日龄,除藏鸡母鸡之外,FST和EGR1在白羽肉鸡各个组织(垂体、下丘脑、胸肌和腿肌)中的表达水平逐渐高于在藏鸡中的表达水平。构建时序表达谱:藏鸡FST时序表达谱(1~150日龄)显示,FST在垂体组织中表现为先上升后下降的表达趋势,在下丘脑组织中则为先下降后上升,再下降的趋势,而肌肉组织中FST在1日龄时有较高的表达水平,但在发育前期(1~42日龄)急剧下降,然后维持在一个稳定水平内;FST在白羽肉鸡中的时序表达(1~42日龄)变化与在藏鸡中表达变化规律一致。藏鸡EGR1时序表达谱(1~150日龄)显示,垂体组织EGR1出现先下降,后上升,再下降的规律,在70日龄时表达水平最高。在下丘脑组织中EGR1表现为先下降后上升,然后维持稳定。在肌肉组织中EGR1在1日龄表达量较高,但在1~42日龄就急剧下降,然后维持稳定;白羽肉鸡1~42日龄,垂体组织EGR1和下丘脑组织EGR1的表达量表现为上升趋势,肌肉组织EGR1则表现为下降趋势。对藏鸡和白羽肉鸡垂体组织表达谱测序分析发现9个具有显著差异表达的基因。藏鸡对白羽肉鸡而言有5个基因(FST、GH、LHFPL5、BPIFB7、NPY)表达上调,4个基因(PTHLH、EGR1、IGF2BP1、SHH)表达下调。对该9个基因的分析显示EGR1、IGF2BP1、SHH基因的下调是导致藏鸡早期的生长缓慢的重要因素。这些现象符合藏鸡生长在青藏高原高寒条件下的生物学特征,同时也符合藏鸡选育程度较低的事实。FST及EGR1在藏鸡与白羽肉鸡垂体组织中的表达规律的差异与42日龄白羽肉鸡的生长速度达到高峰,藏鸡70日龄生长速度达到高峰的生长规律一致,这也与我国大多地方鸡种生长规律一致。因此,FST、EGR1、IGF2BP1、及SHH基因是我国地方鸡种早期生长速度选育的重要候选基因。