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研究背景早发性卵巢功能不全(prematureovarianinsufficiency,POI)是女性在40岁前出现卵巢功能减退,主要表现为以闭经/月经稀发或频发为主要特征的月经异常及促性腺激素水平升高(基础FSH>25U/L)、雌激素水平波动性下降的一种综合征。西医推荐本病的指南标准治疗是激素替代疗法,对缓解近期临床症状和远期并发症都有一定的有益影响。各种病因引起POI,其机制均可能由卵泡颗粒细胞凋亡引起卵泡异常闭锁、卵巢功能损害。因此,阻止颗粒细胞凋亡,抑制异常卵泡闭锁是保护卵巢功能,延缓甚至逆转卵巢功能下降的重要途径。骨形态发生蛋白7(Bonemorphogenetic protein-7,BMP-7)是转化生长因子β超家族的一种同源二聚糖蛋白,有研究表明BMP-7有较强的抑制卵泡颗粒细胞凋亡的作用,但对其抑制颗粒细胞凋亡的信号通路尚有争议,亦缺少中医药干预BMP-7影响卵巢功能或治疗女性生殖系统疾病的机制探讨。因此,从中医药角度探讨POI发病机制,对于临床治疗有重要意义和实际应用价值。补肾促卵方是导师三十余年临床经验的总结,并从毒理、药效、临床方面进行系统研究。本方以补肾为主,兼以活血为原则的中药制剂。前期多项临床观察表明补肾促卵方在改善血清性激素指标、增加窦卵泡数量、促进卵泡发育成熟、顺利排出,提高子宫内膜容受性和妊娠成功率方面具有良好临床效果。本研究以卵巢颗粒细胞为切入点,探讨补肾促卵方治疗POI的作用机制,为提高临床疗效提供科学依据。目的研究分在体实验及离体实验两部分。在体实验通过雷公藤多苷建立POI小鼠模型,通过检测小鼠血清性激素水平、卵泡发育情况、颗粒细胞凋亡率及相关蛋白表达,探讨补肾促卵方治疗POI的作用机制。离体实验通过补肾促卵方含药血清干预雷公藤多苷诱导的小鼠卵巢颗粒细胞,检测细胞增殖率、凋亡率及相关蛋白,观察补肾促卵方含药血清对小鼠卵巢颗粒细胞的保护作用,并探索其作有的信号通路。方法(一)造模实验雌性Balb/c小鼠随机分为空白1组、空白2组、空白生育组;模型组、模型恢复组、模型生育组。3个模型组予以80mg/(kg·d)雷公藤多苷混悬液灌胃,3个空白组予等量生理盐水灌胃14天后,检测其动情周期、血清性激素、性腺指数、卵巢形态、卵泡计数及生育力。(二)在体实验雌性Balb/c小鼠,随机分为空白组、模型组、中药组、阳性对照组。造模后,中药组的小鼠予以补肾促卵方18.35g/(kg.d)灌胃,阳性对照组的小鼠予以戊酸雌二醇溶液0.15mg/(kg·d)灌胃,空白组和模型组的小鼠予等量生理盐水灌胃14天后,检测其动情周期、性腺指数、血清性激素、卵巢形态及卵泡计数、卵泡颗粒细胞凋亡率、卵巢组织BMP-7、caspase-3蛋白表达。(三)离体实验提取Balb/c小鼠卵巢颗粒细胞,分为空白组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、阳性对照组,加入对应含药血清并培养后,检测细胞增殖率筛选最佳补肾促卵方剂量,剔除无效剂量组。再分空白组、模型组、中药组、阳性对照组,加入对应血清培养后,检测细胞凋亡率、BMP-7和caspase-3蛋白表达水平。离体培养的颗粒细胞分为6组:中药组、Smad通路抑制组、p38 MAPK通路抑制组、NF-κB通路抑制组、PKA通路抑制组、PI3K通路抑制组,分别加入对应血清及通路抑制剂培养后,检测BMP-7、caspase-3 mRNA及蛋白表达水平。结果(一)造模实验结果雷公藤多苷灌胃可显著增高模型组小鼠动情周期紊(P<0.01),上调小鼠血清FSH(P<0.01)、LH水平(P<0.05),下调E2水平(P<0.05);降低小鼠卵巢指数和子宫指数(P<0.05);减少小鼠原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、格拉夫卵泡和黄体数量(原始卵泡P<0.01,其余P<0.05),增加闭锁卵泡数量(P<0.01),降低小鼠产仔数和仔鼠存活数(P<0.05)。(二)在体实验结果与模型组相比,补肾促卵方可降低小鼠动情周期紊乱率(P<0.01);升高小鼠卵巢指数(P<0.05);降低FSH水平(P<0.05),升高E2、AMH水平(P<0.05);增加原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和黄体数量(P<0.05),减少闭锁卵泡数量显著减少(P<0.05);降低颗粒细胞凋亡率(P<0.01);上调小鼠卵巢组织中BMP-7蛋白表达(P<0.05),下调caspase-3蛋白表达(P<0.05)。(三)离体实验结果与模型组相比,补肾促卵方中剂量含药血清可在培养的96-144h增加小鼠卵巢颗粒细胞增殖率(P<0.05);可降低颗粒细胞凋亡率(P<0.01);上调BMP-7蛋白表达(P<0.05),下调caspase-3蛋白表达(P<0.05)。和补肾促卵方组相比,Smad通路抑制组、NF-κB通路抑制组的BMP-7 mRNA相对表达量明显减少(P<0.05),caspase-3 mRNA相对表达量明显增加(P<0.05);与补肾促卵方组相比,Smad、p38 MAPK和NF-κB通路抑制组的BMP-7蛋白表达量明显减少(P<0.05),Smad通路抑制组和NF-κB通路抑制组的caspase-3蛋白表达量明显增加(P<0.05)。结论1.连续14天80mg/(kg·d)雷公藤多苷灌胃可成功建立早发性卵巢功能不全小鼠模型,且停止灌胃14天卵巢功能无法完全恢复。2.补肾促卵方可使模型小鼠血清激素水平恢复正常、增加原始卵泡及各级生长卵泡数量、减少闭锁卵泡数量、上调BMP-7、下调caspase-3蛋白表达,从而减少颗粒细胞凋亡率,实现保护卵巢功能的作用。3.补肾促卵方含药血清可通过上调BMP-7表达水平、下调caspase-3表达水平,有效抑制雷公藤多苷含药血清诱导的离体小鼠卵巢颗粒细胞凋亡、维持其增殖率。补肾促卵方可能通过Smad和NF-κB两条信号通路对BMP-7、caspase-3进行调控。