目的和意义CD24是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞表面的高度糖基化的小分子量黏蛋白样黏附分子,在细胞内具有不同的糖基化模式。许多研究表明,CD24在多种肿瘤细胞中高表达,与肿瘤细胞的发生发展和预后密切相关。使用CD24单克隆分子抗体或者CD24特异性siRNA可以抑制肿瘤细胞的增殖,但是在HCT116和HT29大肠癌细胞中,改变CD24的表达对细胞的增殖和凋亡并无明显影响。热休克蛋白Hsp90是维持蛋白质构象的重要分子伴侣。Hsp90与自噬调节密切相关。本课题组前期实验结果提示CD24是分子伴侣Hsp90的相互作用蛋白,使用Hsp90抑制剂能够促使CD24降解。因此,本课题组进一步验证在大肠癌细胞HCT116和HT29中,CD24对增殖和凋亡是否有影响,并研究CD24是否能介导自噬,介导的自噬是否为生存性过程及探讨其内在的调控机制。为以CD24为靶标的分子靶向治疗提供新的思路及探讨联合治疗的可行性。材料和方法1、主要材料HCT116和HT29细胞株为南方医院消化病研究所细胞培养室保存；pcDNA3.1(+)-CD24质粒、pcDNA3.1(+)空载体(Vector)由南方医院消化病研究所提供。CD24siRNA、Atg5siRNA(吉玛),GFP-LC3B (Addgene), RPMI-1640培养基(Hyclone), LipofectamineTM2000(Invitrogen), Opti-MEM(Invitrogen), Cell counting kit-8(Beyotime), Hoechst staining33258(Beyotime),3-甲基腺嘌呤(Sigma), BAY11-7082(Beyotime), β-actin(中杉金桥),CD24抗体由德国肿瘤研究中心Peter教授提供,p62、Beclin-1、LC3A、LC3B、Atg5. Atg3、 Atg7、cleaved caspase-3、cleaved-PARP、IκBα、NF-κBp65、phospho-NF-κBp65(Cell Signaling Technology),抗兔HRP标记二抗(Cell Signaling Technology),抗鼠HRP标记二抗(中杉金桥)。2、主要方法2.1细胞培养HCT116细胞和HT29细胞在应用含有10%胎牛血清的RMPI-1640完全培养液,置于5%CO2、37℃培养箱进行常规培养。2.2质粒或siRNA的瞬时转染CD24重组质粒已由课题组前期构建,CD24siRNA序列：5’-UCUCUCUUCUGCAUCUUUAdTdT-3’, CD24NC序列：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’, Atg5siRNA序列:5’-GCAACTCTGGATGGGATTG-3’, Atg5NC序列：5’-TAAGGCTATGAAGAGATAC-3’。 HCT116细胞和HT29细胞常规培养,按Lipofectamine2000TM产品说明书将质粒或siRNA转染进细胞。转染后48h做相应的后续实验。2.3细胞浆蛋白和核蛋白的提取转染48h后,细胞用冰PBS冲洗3次,按细胞核细胞浆提取试剂盒(碧云天)产品说明书分别提取细胞核蛋白和浆蛋白,用BCA法测定蛋白浓度。2.4蛋白印迹实验细胞用冰的PBS冲洗2次,在冰上用RIPA裂解液裂解30分钟,4℃下12,000g离心15分钟,吸取上清液。用BCA方法测定蛋白浓度。配置8-15%蛋白电泳分离胶和5%的积层胶,蛋白变性上样,上样量为20-30ug,80V-110V,80min电泳后,恒流100-200mA,30min-2h湿转到PVDF膜上,用5%的脱脂牛奶室温下封闭1h,4℃孵一抗(1：1000)过夜,TBST洗涤3次,次日室温孵育二抗(1:2000)1h, TBST洗涤后,ECL化学发光检测。2.5GFP-LC3B荧光观察p-EGFP-LC3B表达质粒从Addgene公司购买,编号为11546.HCT116和HT29细胞培养在12孔板上,按Lipofectamine2000TM产品说明书,在HCT116细胞中将p-EGFP-LC3B表达质粒和CD24过表达质粒共转染,在HT29细胞中,将p-EGFP-LC3B表达质粒和CD24siRNA共转染。转染后48h,在荧光显微镜下观察绿色荧光情况。含两个以上自噬小泡的细胞为自噬阳性细胞,在每种细胞类型,计数50个细胞中自噬阳性的细胞数。2.6细胞增殖实验CCK-8试剂用于细胞增殖的检测。转染后的细胞接种于96孔板,细胞数为10000个/孔,处理组加入自噬抑制剂或同时敲低Atg5基因,在RPMI-1640完全培养基中培养,每组设6个复孔,培养48h或72h后,吸取完全培养基,加入10%浓度的CCK-8溶液,放入培养箱中继续培养3h后,在450nm的波长下,酶联免疫分析仪测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横轴,吸光度为纵轴比较各组吸光度值得差异,数据以mean±SD表示。2.7Hoechst33258染色采用Hoechst33258染色测定细胞的凋亡。将HCT116和HT29细胞分别铺于培养皿上12mm的载玻片上。转染或共转染后,并接受不同的处理后,细胞在4%的多聚甲醛中固定,按Hoechst33258染色产品说明书,染色20min,在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察染色结果。每200个细胞中计数出现核固缩、核分裂的细胞数目。2.8自噬和NF-κB通路的抑制3-甲基腺嘌呤(3-MA)是磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂,抑制自噬小体的形成,Bay11-7082是NF-κB抑制剂。细胞转染后铺于6孔板中培养24h,加入10mM的3-MA继续培养24h或加5uM的Bayll-7082继续培养12h后,做相应后续实验。2.9数据统计所有实验重复至少3次。数据均以mean±SD表达。结果均经SPSS软件统计分析,细胞增殖实验取3次结果中的一次结果为统计结果。两组之间的比较采用t检验,三组及三组以上的比较采用方差分析(one-way ANOVA),多重比较采用LSD法。所有统计结果以p<0.05作为有统计学意义。参数比较前进行方差齐性检验,在方差齐性的基础上进行比较。结果1、CD24在结肠癌细胞中能介导自噬前期研究结果已表明HCT116细胞中CD24低表达,HT29细胞中CD24高表达,因此我们在HCT116细胞中转染CD24高表达质粒,并在HT29细胞转染CD24siRNA。蛋白印迹实验检测CD24,转染后,HCT116细胞CD24表达增高(CD24OE),而HT29细胞CD24表达降低(CD24KD)。同时在转染后的细胞中检测自噬相关蛋白(Beclin-1,Atg3,Atg5,LC3A,LC3B)的表达情况,发现在HCT116细胞中,与对照组(CD24VEC)对比,过表达CD24引起自噬蛋白表达水平降低,在HT29细胞中,与对照组(CD24NC)对比,敲低CD24能引起自噬蛋白表达水平升高。为了进一步验证调节CD24的表达能否介导自噬,在HCT116细胞中共转染GFP-LC3B质粒和CD24高表达质粒,在HT29细胞中共转染GFP-LC3B质粒和CD24siRNA,结果提示,在HCT116细胞中,过表达CD24组发现自噬小泡阳性细胞数显著低于对照组(P=0.000),在HT29细胞中,敲低CD24组发现自噬小泡阳性细胞数显著高于对照组(P=0.000)。2、CD24在结肠癌细胞中对细胞增殖和凋亡无明显影响前期研究表明,应用CD24抗体或CD24siRNA能有效抑制肿瘤细胞的增殖,导致更多的细胞死亡。然而,有研究发现,在结肠癌HCT116和HT29细胞中,过表达CD24或敲低CD24对细胞的增殖和凋亡无明显影响。这些研究结论的不一致促使我们进一步研究在HCT116和HT29细胞中,改变CD24的表达到底对细胞的增殖和凋亡有无影响。CCK-8实验检测细胞增殖,细胞转染后48h和72h,检测细胞在450nm波长上的吸光度值(OD),在HCT116细胞中,培养48h后实验组和对照组的OD值无统计学差异(CD24OE vs CD24VEC P=0.115; CD24OE vs Control P=0.311),培养72h后实验组和对照组的OD值无统计学差异(CD24OE vs CD24VEC P=0.637; CD24OE vs Control P=0.279).在HT29细胞中,培养48h后实验组和对照组的OD值无统计学差异(CD24KD vs CD24NC P=0.070; CD24KD vs Control P=0.097),培养72h后实验组和对照组的OD值无统计学差异(CD24KD vs CD24NC P=0.459; CD24KD vs Control P=0.258)。为了进一步检测对细胞凋亡的影响,采用蛋白印迹法和Hoechst33258染色。蛋白印迹实验提示实验组和对照组的凋亡相关蛋白(c-caspase3和c-PARP)表达无明显差异。Hoechst33258染色实验提示,在HCT116细胞中,实验组和对照组的细胞核中发现的染色质固缩,分裂和凋亡小体量无显著差异(CD24OE vs CD24VEC P=0.612; CD24OE vs Control P=0.136),在HT29细胞中,实验组和对照组的细胞核中发现的染色质固缩,分裂和凋亡小体量无显著差异(CD24KD vs CD24NC P=0.403; CD24KD vs Control P=0.269)3、在结肠癌细胞中,CD24介导的自噬是生存性过程自噬是一种动态过程,刚开始产生自噬小泡,并最终在溶酶体内降解,因此在细胞内可以产生自噬流。P62蛋白是产生功能性自噬流的标志性蛋白,是自噬小泡的一部分并最终能在溶酶体内降解。为了检测CD24是否介导了功能性自噬流,蛋白印迹法检测P62蛋白的表达情况。结果提示,CD24OE组中,P62蛋白的表达量在24h-72h显著升高,CD24KD组中,P62蛋白的表达量在24h-72h显著降低。同时,在转染后的两种细胞中加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)后,能够明显抑制自噬相关蛋白的表达。由此得出,CD24在两种细胞中可以介导功能性自噬流。为了验证CD24介导的自噬是否为生存性过程。首先采用自噬抑制剂3-MA抑制自噬的表达,蛋白印迹实验显示加入3-MA组自噬相关蛋白(Beclin-1,Atg5)表达量明显降低,同时检测凋亡蛋白的表达情况,在HCT116细胞中,CD24OE+3-MA组凋亡蛋白(c-caspase-3,c-PARP)表达量明显低于其他实验组和对照组,在HT29细胞中,CD24KD+3-MA组的凋亡蛋白(c-caspase-3,c-PARP)表达量明显高于其他实验组和对照组。同时进行细胞增殖实验和Hoechst33258凋亡染色,CCK-8细胞增殖实验结果显示：在HCT116细胞中,CD24OE+3-MA组的细胞增殖速率高于其他实验组和对照组(CD24OE+3-MA vs CD24VEC+3-MA, P=0.022; CD24OE+3-MA vs CD24OE, P=0.001; CD24OE+3-MA vs CD24VEC, P=0.004),在HT29细胞中,CD24KD+3-MA组的细胞增殖速率低于其他实验组和对照组(CD24KD+3-MA vs CD24NC+3-MA, P=0.006; CD24KD+3-MA vs CD24KD, P=0.004; CD24KD+3-MA vs CD24NC, P=0.000)。 Hoechst33258凋亡染色结果显示：在HCT116细胞中,CD24OE+3-MA组的凋亡速率显著均低于其他组(P=0.000),在HT29细胞中,CD24KD+3-MA组的凋亡速率显著均高于其他组(P=0.000)。在两种细胞株中通过转染Atg5siRNA,蛋白印迹实验检测Atg5,提示在两种细胞中Atg5蛋白的表达量均明显下降。然后检测凋亡相关蛋白(c-caspase-3,c-PARP)的表达情况,在HCT116细胞中,CD24OE+Atg5KD组凋亡相关蛋白表达量显著低于其他实验组和对照组,在HT29细胞中,CD24KD+Atg5KD组凋亡相关蛋白表达量显著高于其他实验组和对照组,同时检测细胞增殖速率和对细胞进行Hoechst33258染色检测凋亡。CCK-8细胞增殖实验结果显示：在HCT116细胞中,CD24OE+Atg5KD组的细胞增殖速率均高于其他实验组和对照组(CD24OE+ATG5KD vs其他组,P<0.01),在HT29细胞中,CD24KD+Atg5KD组的细胞增殖速率均低于其他实验组和对照组(CD24KD+ATG5KD vs其他组,P=0.000)。Hoechst33258凋亡染色结果显示：在HCT116细胞中,CD24OE+Atg5KD组的凋亡速率均明显低于其他组(P=0.000),在HT29细胞中,CD24KD+Atg5KD组的凋亡速率均明显高于其他组(P=0.000)。4、CD24介导的生存性自噬至少部分由NF-κB通路调控大量研究表明,NF-κB通路与自噬的介导密切相关。为了进一步探讨CD24介导的生存性自噬的潜在调控机制,细胞转染后,分别提取细胞的总蛋白,浆蛋白和核蛋白。采用蛋白印迹法检测NF-κB通路中关键调控分子1κBα,NF-κBp65and phospho-NF-κBp65的蛋白表达量。在HCT116细胞中,过表达CD24,phospho-NF-κBp65表达量升高,1κBα和NF-κBp65表达量降低,在HT29细胞中,敲低CD24,phospho-NF-κBp65表达量降低,IκBα和NF-κBp65表达量升高。为了进一步明确NF-κB通路在CD24调控自噬中的角色,在转染后的两种细胞中加入NF-κB通路抑制剂Bay11-7082,以加入DMSO为对照。蛋白印迹结果提示,加入Bayll-7082的细胞组抑制自噬相关蛋白(Beclin-1, Atg5, LC3B)的表达,GFP-LC3B荧光观察结果提示,在加入Bayll-7082抑制剂后的HCT116和HT29细胞组中,50个细胞中出现自噬小泡的细胞数显著低于其他组(P=0.000)。综上所述,CD24介导的生存性自噬至少部分由NF-κB通路调控。结论本研究通过体外细胞学实验提示,在大肠癌HCT116和HT29细胞中,CD24能介导自噬,改变CD24的表达水平,对细胞的增殖和凋亡无明显影响,通过抑制自噬的表达后,发现CD24在细胞中介导的自噬是生存性过程。同时发现了CD24介导的生存性自噬至少部分由NF-κB通路调控。