线粒体是细胞内重要的细胞器,线粒体分裂-融合平衡对线粒体功能及细胞的影响至关重要。细胞内线粒体相互连接成网格状结构,需要不断的分裂-融合来维持其正常结构,维持细胞正常生命活动。在疾病情况下细胞内线粒体分裂-融合动态平衡发生紊乱。线粒体融合蛋白2(MFN2)定位于线粒体外膜或内质网,作为线粒体融合蛋白家族的重要一员,主要参与调控线粒体融合。除此之外,MFN2还参与线粒体转运,线粒体自噬,增殖,凋亡等细胞生命活动。最近许多的研究结果显示MFN2在多种恶性肿瘤中异常表达,并介导多种癌症的恶性进展。我们研究发现MFN2的表达水平在肝癌组织细胞中显著降低,并且与肝癌病人的不良预后相关。肝癌作为一种常见的恶性肿瘤,是全球第六大最常见的癌症类型。原发性肝癌按病理学分型可分为肝细胞肝癌(HCC)、肝内胆管细胞癌(ICC)和混合型肝癌(c HCC-ICC)三种类型。其中以肝细胞肝癌最为常见,约占原发性肝癌的75%~80%左右。HCC患者的预后较差,5年生存率较低。鉴于肝癌传统治疗具有局限性,使用新方法、新技术深度探索肝癌的发病机制,寻找新的治疗靶点成为肝癌治疗新风向。因此,我们提出假说:MFN2作为抑癌因子,可以通过调控肝癌细胞增殖与凋亡,进而抑制肝癌的发生与恶性进展。【目的】本课题以肝癌为研究对象,观察线粒体分裂-融合动态平衡在肝癌中的变化情况,选择线粒体融合关键分子MFN2,明确MFN2在肝细胞癌发生的中所扮演角色,探索MFN2影响肝癌发生及生长的作用机制。【方法】1.利用免疫组化实验分析MFN2在人肝癌组织中的表达水平,并分析MFN2表达水平与肝癌患者预后间的相关性。利用MTS测定细胞生长曲线、EDU细胞增殖、Annexin V-FITC-PI双染法凋亡检测以及克隆形成实验分析MFN2对肝癌细胞生长的作用。2.采用SB转座子系统介导的高压尾静脉注射转染技术在小鼠肝脏内共表达AKT/c-Met癌基因质粒,诱导小鼠形成自发肝癌模型。3.采用高压尾静脉注射转染法将Cre重组酶和AKT/c-Met质粒同时高压转染到MFN2fl/fl小鼠中以观察肝细胞特异性敲除MFN2对AKT/c-Met诱导肝癌发生的影响。4.利用Western Blot实验检测细胞增殖、细胞凋亡相关分子的改变,初步分析MFN2缺失促使肝癌发生及生长的作用机制。【结果】第一部分:通过对临床样本进行分析,发现MFN2在肝癌组织中的表达水平显著低于相应的癌旁组织,且MFN2低表达患者的总生存期和无复发生存期较MFN2高表达患者有显著缩短。通过细胞实验发现MFN2通过减缓细胞增殖并促进细胞凋亡从而抑制肝癌细胞生长第二部分:通过高压尾静脉转染方法成功构建了AKT/c-Met小鼠自发肝癌模型。通过免疫组化染色、Western Blot及RT-PCR等实验研究发现MFN2在小鼠肝癌组织中的表达水平相较于癌旁组织显著下降,又通过透射电镜观察肝癌组织中线粒体组织形态的改变发现肝癌组织中线粒体分裂显著增多。第三部分:通过对肝脏特异敲除MFN2小鼠体内肝癌形成过程的观察及其肝癌组织的研究,发现MFN2缺失可以促进体内肝癌发展进程,加速肝癌形成,且敲除MFN2后小鼠肝癌的恶性程度变高,小鼠生存期明显缩短。第四部分:通过对增殖相关分子、凋亡相关分子、p53等表达水平的检测,发现肝细胞内MFN2缺失可导致p53通路的失活,加快肝癌细胞增殖,减少肝癌细胞凋亡,加速肝癌进程。【结论】经过本课题研究发现:人肝癌组织中MFN2表达降低,其表达水平与患者预后相关。MFN2作为线粒体融合关键分子,肝细胞MFN2缺失导致线粒体动态平衡紊乱,从而使p53通路失活,调控肝癌细胞的增殖凋亡,最终加速肝癌形成。