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大肠癌是发病率最高的恶性肿瘤之一，在我国已位居第四位，死亡率呈逐年上升趋势。探讨有效的诊断和治疗手段是大肠癌研究的重要课题。近年来以单克隆抗体作为载体的大肠癌导向诊断和治疗取得了一定进展，但由于鼠源性抗体带有较强的免疫源性，多次给药易产生人抗鼠抗体(HA-MA)，同时完整抗体分子过大，难以穿透肿瘤毛细血管，严重限制了其临床应用，为此，采用基因工程技术将鼠源性抗体进行改造，制备新型抗体成为近年抗体研究的热点。单链抗体是目前应用最为广泛的重组抗体，它由抗体分子中构成抗原结合部位的重链可变区和轻链可变区借助一连接短肽连接而成，由于只保留了Ⅴ区，免疫源性大大降低，同时由于没有Fc段，不能与非靶细胞的Fc受体结合，更利于集中到达肿瘤部位。此外，完整抗体在构建为单链抗体后，其分子量通常只为原有分子的1/5或1/6，较小的分子量使其在肿瘤组织中的分布指数，即肿瘤摄取量与正常组织摄取量的比值较完整抗体明显升高，有利于作为导向药物的载体。 最大限度地发挥单抗作为导向载体的功能是肿瘤导向治疗的关键所在。抗体介导的酶解前药疗法(Antibody directed enzyme prodrug therapy，ADEPT)是近年发展起来的颇具应用前景的肿瘤导向治疗新途径，它以巧妙的设计克服了以往单抗作为药物载体的许多缺陷，日益受到广泛关注，并已有效应用于临床。其基本思想是将单克隆抗体与一种活化酶交联，制备抗体-酶偶联物，借助抗体识别瘤细胞表面抗原的特性，把酶带到靶部位，某些无抗癌活性或低活性的前体药在酶的催化下可转化为细胞毒性药物，实现抗癌药物在靶部位的特异性释放，提高疗效。它的优势在于①显著降低药物毒性。由于前药本身为低毒性或无毒性，只有被定位于靶部位的酶激活后，才能转化为具有细胞毒性的药物，减低了对正常组织的损伤。②提高肿瘤局部的药物浓度。由于酶分子作用机制的特殊性，单一酶分子具有水解多个前药分子的潜能，提供了一种放大作用，使活性药物以高浓度定位于肿瘤局部。③提供旁观者效应，有效解决肿瘤细胞表面抗原表达异质性问题。目前以羧肽酶G2构成的ADEPT系统已进入临床Ⅱ试验。 ND-1是宋今丹于1983年以人大肠癌细胞系CCL-187为免疫源制备的鼠抗人大肠癌单克隆抗体，已进行的近千例临床病理检测显示，该单抗对高中分化大肠癌组织具特异结合活性，并优于目前广泛采用的美国商业产品抗CEA单抗。该单抗与天花粉蛋白偶联制备的免疫毒素和与载有紫杉醇的脂质体偶联制备的免疫脂质体在体外均显示了良好的靶向杀伤作用。应用‘3，I标记的ND一1单抗在裸鼠体内的放射免疫显像亦显示了良好效果。在此基础上，本实验将抗人大肠癌单克隆抗体ND一1的重链和轻链可变区基因进行重组构建了单链抗体ND一1 scFv，并成功地在大肠杆菌中进行了有效表达。在证实ND一1 scFv具有满意的免疫学活性，在动物体内呈特异性分布后，将ND一1单抗的单链抗体基因与酵母胞嗜吮脱氨酶(cy-tosine dea而nase，CD)基因融合，在大肠杆菌中成功地表达了单链抗体与酶的融合蛋白，并测定了其与5一氟胞喃吮构成的ADEPr系统对靶细胞的杀伤作用，希望为大肠癌的临床诊断和治疗提供新的途径和手段。 1.采用RT一PCR技术从能够分泌ND一1单抗的鼠杂交瘤细胞IC一2中扩增VL和VH基因，通过重叠延伸拼接PCR在VH和V:基因序列间引人连接短肤，体外构建scFv基因，经常规转化和筛选将其克隆至PET一28a(+)表达载体并由IPTG诱导在E.Coli BL21中表达ND一lscFv蛋白。序列分析表明:ND一1 scFv基因全长732bp，vH基因在上游，片段长度354bp;V:基因在下游，片段长度 330bp，中间为柔性Unker序列，长度45bp，两侧为通过PCR引入的EcoRI和Hindl酶切位点，与Gene bank中相关序列比较证实，该scFv片段具有鼠源性抗体特征，由鼠源性抗体重链可变区和轻链可变区组成，轻链为K链。SDS一PAGE检测显示，重组蛋白的相对分子量为30KD，包括scFv和蛋白标签6 x His一tag以及载体上游序列，与理论推算值相符。凝胶灰度扫描结果显示scFv蛋白表达量随诱导时间增加而增加，至4小时达到诱导高峰，表达量占菌体总蛋白量的16%，同时本实验利用镍一次氨基三乙酸(Ni一NTA resin)金属亲和层析基质对6 x His一tag的特异亲和性完成了对scFv的纯化，获得了纯度为94%的高纯度表达蛋白，蛋白浓度高达1 .sm岁血，为该单链抗体在临床的广泛应用提供了可能。 2.对诱导表达并经纯化复性的ND一1 scFv进行了间接免疫荧光检测，结果显示，表达有ND一1相应细胞表面抗原LEA的CCL一187细胞经ND一1 scFv处理后，细胞膜表面呈现明显的荧光，而在LEA表达阴性的人宫颈癌细胞HeU表面未见荧光显示，提示ND一1 scFv具有良好的抗体活性，并能特异性与靶细胞结合。EUSA定量检测显示，ND一1 scFv具有与亲本ND一l相近的靶细胞结合活性，对表达有ND一1相应细胞表面抗原LEA的CCL一187细胞的结合能力强，对比A表达阴性的人宫颈癌细胞HeLa的结合能力弱，提示ND一1抗体活性在构建成单链抗体后仍得到较好的保留。 3.将ND一lscFv与