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MiARF2基因是从芒果子叶横切段的不定根形成所克隆的生长素反应因子ARF2类基因,已证明它与芒果子叶切段不定根的形成有关,为上调表达或诱导表达基因。本文研究转MiARF2基因的烟草和拟南芥不定根发生的能力变化,分析MiARF2基因在不定根形成过程中的生物学功能。主要的研究结果如下:
1.经过Basta(6 mg/L)的抗性筛选及叶片PCR分析,从一批待检测的拟转MiARF2基因烟草株系中初步筛选出3个株系(B1、B2、B3株系),并通过Southern杂交证明外源MiARF2基因已整合到烟草基因组中,且在3个转基因烟草株系中均为单位点插入。RT—PCR证明外源MiARF2基因在转基因株系中均可正常转录。
2.以转MiARF2基因烟草三个株系的T1代种子在光照条件下萌发并培养30天左右,生长至约5 cm的无菌苗的叶片切块(1 cm×1 cm)为外植体,接种至不定芽诱导培养基上,在28℃光照条件下培养,待不定芽高度为1 cm左右时,将其接种于生根培养基中,对不定根发生能力进行比较。结果发现,转入MiARF2基因的烟草其第一条不定根出现时间早于野生型约1天。生根培养15天不定根数量相对于野生型没有显著变化。但生根培养30天后,转MiARF2基因的烟草3个株系的不定根根长比野生型(对照)分别增加了29.3%、30.2%、30.4%,达到显著效果(n=12,P<0.05);而其不定根的干重也比对照的分别增加31.0%、33.0%、35.7%(n=12,P<0.05)。
3.以转MiARF2基因的拟南芥三个株系的T4代自交纯合子为测试样本,野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana,Col)为对照,将种子在光照条件下萌发,分别切取种子萌发12-14天的植株的下胚轴(长约5 mm),接种于含0.5 mg/L IBA的MS培养基中,28℃黑暗培养12天。经测量及统计分析后得出的结果为:转基因拟南芥与野生型株系不定根数均为1-2根,转基因拟南芥的不定根比野生型不定根长26.7%左右(n=28,P<0.05)。
由以上实验结果,我们推测芒果转MiARF2基因对烟草及拟南芥不定根的生长有促进作用。MiARF2基因的表达可能与不定根原基的启动与发育密切相关。MiARF2异位表达所引起其下游基因的表达变化的具体分子机制还有待进一步研究。