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背景小檗碱类生物碱是中国传统中药黄连等道地药材中提取分离的主要活性成分,属于异喹啉类生物碱。其中小檗碱在临床上最先被应用于治疗痢疾杆菌引起的胃肠道感染和腹泻,具有显著的抗菌抗炎作用,近期研究发现小檗碱还具有抗肿瘤、降脂、降糖和治疗心血管疾病等药理作用。小檗碱因其广泛的药理活性成为药物研究的热点,研究人员对小檗碱类生物碱进行结构的修饰和改造,希望提高或拓展小檗碱类化合物对于疾病治疗的药理作用。目前研究主要通过化学修饰的方式对小檗碱进行结构改造,但存在反应条件苛刻、产物效率低、成本高和试剂污染等问题,而使用微生物转化的方式能够避免化学合成所带来的问题。微生物转化是微生物细胞对底物进行结构修饰的过程,目前广泛应用于食品、药品和复杂化合物的生产与制备过程中,然而有关微生物转化小檗碱的研究相对较少。研究发现土壤微生物能够转化小檗碱进行羟基化修饰和去甲基化修饰,为我们进一步研究小檗碱的微生物转化和得到新化合物奠定了基础和理论可行性。目的对黄连根际土壤微生物进行筛选得到新的小檗碱转化菌株,通过微生物转化获得新颖的小檗碱衍生物并研究其抗菌活性,克隆微生物转化小檗碱的相关基因并阐明其酶学特性。方法1.采用液体培养法筛选黄连根际土样的微生物,分离获得以小檗碱为主要碳源的菌株,提取基因组扩增16S r RNA序列测序鉴定菌株种类。采用静息喂养法观察分离菌株诺卡氏菌Nocardia sp.A056对小檗碱的转化效果,并使用高效液相检测培养过程中小檗碱的含量变化和新化合物。2.将Nocardia sp.A056以小檗碱为底物进行大量发酵后累积转化产物,通过萃取浓缩获得产物粗浸膏,使用MCI柱层析对目标化合物进行极性分离,半制备液相系统对化合物进行制备分离纯化,获得纯化后化合物。通过液相-质谱联用技术分析小檗碱和转化产物的紫外吸收与分子量,结合文献推断转化产物的结构,同时使用核磁共振技术解析化合物的1H谱、13C谱和二维谱,鉴定转化产物结构。3.为确定转化产物去亚甲基小檗碱的抗菌活性,使用微量肉汤稀释法检测小檗碱和去亚甲基小檗碱对常见几株致病细菌和真菌的MIC。4.通过本地BLAST比较发现基因组中与小檗碱转化相关的基因,提取RNA构建c DNA文库,使用实时荧光定量PCR检测小檗碱转化相关基因的转录水平。5.确定Nocardia sp.A056的上调基因后构建Gcv T29675和Gcv T29730蛋白表达重组质粒,通过小檗碱诱导的全细胞转化的方式验证宿主内蛋白的活性,使用Ni柱亲和层析纯化表达蛋白,体外生化体系确认蛋白活性,并通过添加不同底物进行体外催化验证Gcv T29730的底物特异性。6.通过构建系统进化树与氨基酸序列比对分析Gcv T29730的功能特性。将点突变蛋白表达纯化后体外催化验证活性位点;纯化截短蛋白后体外催化验证结构域功能。结果1.从黄连根际土壤中分离获得8株小檗碱转化菌株,其中编号A056的菌株转化效果最好,对A056提取基因组扩增16S r RNA后测序,在线BLAST构建系统发育树分析A056为诺卡氏菌属。静息喂养实验发现在缓冲体系中出现新的吸收峰,并随着时间的变化产生积累的趋势,推测可能为小檗碱转化产物。2.通过制备分离获得纯化后的新化合物,进行紫外全波长扫描并与小檗碱比较,该化合物的紫外吸收和小檗碱基本一致,初步确认为小檗碱转化产物。LC-MS检测化合物分子量为324,小檗碱分子量为336,结合NMR核磁鉴定结果确认该化合物为小檗碱的亚甲二氧基环被催化开环形成的去亚甲基小檗碱。3.检测小檗碱和去亚甲基小檗碱对常见细菌和真菌的MIC,结果发现去亚甲基小檗碱对细菌的抗菌活性弱于小檗碱,说明亚甲二氧基环能够提高小檗碱对细菌的抗菌作用;而对真菌的抗菌活性两者大致相同。4.Nocardia sp.A056全基因组测序后,本地BLAST检索发现基因NPGAP29360、NPGAP29580、NPGAP29675、NPGAP29730的氨基酸序列与已知去亚甲基酶序列具有较高的一致性,且均注释为Gcv T酶合成基因。q PCR结果显示小檗碱诱导后NPGAP29675和NPGAP29730表达量上调。5.在大肠杆菌BL21宿主中异源表达Gcv T29675和Gcv T29730,全细胞转化与体外酶催化结果发现Gcv T29730能够转化小檗碱为去亚甲基小檗碱,Gcv T29675无活性,表明Gcv T29730为催化小檗碱去亚甲基的转移酶。以巴马汀、表小檗碱和黄连碱为底物进行体外酶催化反应发现Gcv T29730不能催化巴马汀和表小檗碱,但能够催化黄连碱去亚甲基,分析底物化学结构表明Gcv T29730能够特异性催化小檗碱类生物碱C2、C3位,使亚甲二氧基环开环。6.通过生物信息学分析构建点突变蛋白表达重组质粒pET28a-29730 E187A和p ET28a-29730 Y247A,通过大肠杆菌宿主异源表达实验和体外酶催化实验发现蛋白点突变后几乎失去转化活性,表明E187和Y247为Gcv T29730的关键活性位点。构建p ET28a-29730 A252t和p ET28a-29730F340t截短蛋白表达重组质粒,体外酶催化实验结果表明截短蛋白会失去转化活性,说明Gcv T29730的结构域均发挥重要作用。结论通过培养分离筛选获得小檗碱转化菌株Nocardia sp.A056,将小檗碱转化为去亚甲基小檗碱,去亚甲基小檗碱在抗真菌方面具有较大的潜力,为微生物转化小檗碱提供了新思路。对Nocardia sp.A056进行全基因组测序,发现小檗碱亚甲基转移酶Gcv T29730,能够特异性催化小檗碱类生物碱C2、C3位的亚甲二氧基环开环形成去亚甲基羟基化衍生物,为后续对小檗碱类化合物的酶法合成与生物转化研究奠定基础。